एन्यूक्लिएटेड लाल रक्त कोशिकाओं के प्रोटीन सक्रियण में गतिशील परिवर्तनों को कैप्चर करना पद्धतिसंबंधी चुनौतियों का सामना करता है, जैसे कि बाद के मूल्यांकन के लिए तीव्र उत्तेजनाओं में गतिशील परिवर्तनों का संरक्षण। प्रस्तुत प्रोटोकॉल नमूना तैयारी और धुंधला तकनीकों का वर्णन करता है जो प्रासंगिक प्रोटीन परिवर्तनों और बाद में पता लगाने के संरक्षण और विश्लेषण को सक्षम करता है।
लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) प्रोटीन की एंटीबॉडी लेबलिंग समग्र प्रोटीन सामग्री में परिवर्तन या प्रोटीन सक्रियण राज्यों में तीव्र परिवर्तन का पता लगाने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली, अर्ध-मात्रात्मक विधि है। यह आरबीसी उपचार के मूल्यांकन, कुछ रोग राज्यों में मतभेदों के लक्षण वर्णन और सेलुलर कोहेरेंस के विवरण की सुविधा प्रदान करता है। तीव्र रूप से परिवर्तित प्रोटीन सक्रियण का पता लगाने के लिए (उदाहरण के लिए, मेकेनोट्रांसडक्शन के माध्यम से) अन्यथा अस्थायी प्रोटीन संशोधनों को संरक्षित करने के लिए पर्याप्त नमूना तैयारी की आवश्यकता होती है। मूल सिद्धांत में विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी के प्रारंभिक बंधन को सक्षम करने के लिए वांछित आरबीसी प्रोटीन के लक्ष्य बाध्यकारी साइटों को स्थिर करना शामिल है। द्वितीयक एंटीबॉडी को संबंधित प्राथमिक एंटीबॉडी से बांधने के लिए इष्टतम परिस्थितियों की गारंटी देने के लिए नमूना को आगे संसाधित किया जाता है। गैर-फ्लोरोसेंट द्वितीयक एंटीबॉडी के चयन के लिए अतिरिक्त उपचार की आवश्यकता होती है, जिसमें बायोटिन-एविडिन युग्मन और धुंधला विकसित करने के लिए 3,3-डायमिनोबेंज़िडाइन-टेट्राहाइड्रोक्लोराइड (डीएबी) का आवेदन शामिल है, जिसे ऑक्सीकरण को रोकने के लिए माइक्रोस्कोप के तहत वास्तविक समय में नियंत्रित करने की आवश्यकता होती है, और इस प्रकार समय पर तीव्रता को धुंधला करना पड़ता है। धुंधला तीव्रता का पता लगाने के लिए, छवियों को एक मानक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके लिया जाता है। इस प्रोटोकॉल के संशोधन में, इसके बजाय एक फ्लोरेसिन-संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी लागू किया जा सकता है, जिसका लाभ यह है कि कोई और विकास कदम आवश्यक नहीं है। हालांकि, इस प्रक्रिया को धुंधला पता लगाने के लिए माइक्रोस्कोप से जुड़े प्रतिदीप्ति उद्देश्य की आवश्यकता होती है। इन विधियों की अर्ध-मात्रात्मक प्रकृति को देखते हुए, गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं और पृष्ठभूमि संकेतों के लिए कई नियंत्रण दाग प्रदान करना अनिवार्य है। यहां, हम विभिन्न धुंधला तकनीकों के संबंधित परिणामों और लाभों की तुलना और चर्चा करने के लिए धुंधला प्रोटोकॉल और संबंधित विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं दोनों को प्रस्तुत करते हैं।
लाल रक्त कोशिकाएं (आरबीसी) 70 से 140 दिनों के लिए कार्डियोवैस्कुलर सिस्टम को पार करती हैं, जिसमें लगभग 115 दिनों की औसत आरबीसी आयु 1,2 होती है। सेनेसेंट या क्षतिग्रस्त आरबीसी को एरिथ्रोफागोसाइटोसिस द्वारा परिसंचरण से हटा दिया जाता है, मैक्रोफेज3 द्वारा संचालित एक कुशल समाशोधन प्रक्रिया। इन कोशिकाओं का पूर्व निर्धारित जीवनकाल विभेदन और परिपक्वता के दौरान नाभिक, माइटोकॉन्ड्रिया और राइबोसोम सहित सेल ऑर्गेनेल को आत्मसमर्पण करने का एक परिणामहै। इस प्रकार, परिसंचारी आरबीसी एक ट्रांसलेशनल मशीनरी से रहित होते हैं, जोनए प्रोटीन 3 के संश्लेषण को प्रभावित करते हैं। यह इस प्रकार है कि मौजूदा प्रोटीन में गतिशील, पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन आरबीसी5 पर कार्य करने वाले बाह्य और इंट्रासेल्युलर तनावों के जवाब में तीव्र, जैव रासायनिक विनियमन के एकमात्र व्यवहार्य तंत्र का प्रतिनिधित्व करते हैं।
यांत्रिक बल मुख्य बाह्य संकेत प्रतीत होते हैं जो आरबीसी के भीतर जैव रासायनिक मार्गों के सक्रियण या मॉड्यूलेशन का कारण बनते हैं। आरबीसी झिल्ली6 में मेकेनोसेंसेटिव प्रोटीन, पीज़ो 1 की खोज नेइन कोशिकाओं में यांत्रिक रूप से सक्रिय सिग्नलिंग की जांच करने वाले अनुसंधान की कई पंक्तियों को प्रेरित किया। उदाहरण के लिए, हाल की प्रगति से पता चला है कि आरबीसी के भौतिक गुणों को प्रोटीन8 के तीव्र और गतिशील परिवर्तनों द्वारा सक्रिय रूप से विनियमित किया जाता है, जिसमें पोस्ट-ट्रांसलेशनल फॉस्फोराइलेशन और सर्वव्यापी9 शामिल हैं। चूंकि ये सामान्य संशोधन कुछ बीमारियों 9,10,11 में भिन्न होते हैं, इसलिए आरबीसी प्रोटीन की सक्रियण स्थिति को निर्धारित करने के लिए वैज्ञानिक और नैदानिक रुचि प्रतीत होती है, विशेष रूप से मेकेनोबायोलॉजिकल प्रक्रियाओं के संबंध में।
आरबीसी प्रोटीन सक्रियण राज्यों में तीव्र परिवर्तनों का निर्धारण कुछ पद्धतिगत चुनौतियां पैदा करता है। उदाहरण के लिए, बाद के विश्लेषण के लिए आरबीसी नमूनों के भंडारण के लिए संशोधित आरबीसी प्रोटीन के संरक्षण की आवश्यकता होती है, क्योंकि पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन गैर-टिकाऊ होते हैं। इसके अलावा, क्लासिक प्रोटीन-डिटेक्शन विधियों (जैसे, पश्चिमी सोख्ता) हीमोग्लोबिन के सापेक्ष प्रोटीन की कम प्रचुरता के कारण आरबीसी में मानकीकृत करना मुश्किल है, जोइन कोशिकाओं में प्रोटीन सामग्री का ~ 98% है। इस प्रकार, रासायनिक रूप से संरक्षित आरबीसी का एंटीबॉडी-आधारित धुंधलापन महत्वपूर्ण आरबीसी प्रोटीन के तीव्र संशोधनों की जांच करते समय पसंद की विधि रही है, जैसे कि नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ (आरबीसी-एनओएस) 13,14 के आरबीसी-विशिष्ट आइसोफॉर्म। आरबीसी-एनओएस को एंजाइमेटिक रूप से नाइट्रिक ऑक्साइड (एनओ) का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है, जो आरबीसी विकृति15,16,17 सहित आवश्यक आरबीसी गुणों के लिए अपरिहार्य लगता है। आरबीसी-एनओएस के पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन उत्प्रेरक एंजाइम गतिविधि को नियंत्रित करते हैं, जिसमें एंजाइम गतिविधि को बढ़ाने के लिए सेरीन 1177 अवशेषों के फॉस्फोराइलेशन का वर्णन किया जाता है, जबकि अवशेषों सेरीन 114 या थ्रेओनिन 495 के फॉस्फोराइलेशन को आरबीसी-एनओएस गतिविधि18,19 में कमी के साथ जोड़ा गया है।
सामूहिक रूप से, आरबीसी प्रोटीन के अस्थायी संशोधन महत्वपूर्ण सेलुलर फ़ंक्शन में योगदान करते हैं, और मानकीकृत प्रोटोकॉल जो इन संशोधित प्रोटीनों का पता लगाने में सक्षम होते हैं, उच्च मूल्य के होते हैं। यहां, हम दो अलग-अलग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो आरबीसी-एनओएस प्रोटीन सक्रियण का पता लगाने की सुविधा के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का फायदा उठाते हैं, और डेटा विश्लेषण और व्याख्या के लिए सिफारिशों पर चर्चा करते हैं।
वर्णित प्रोटोकॉल के प्रदर्शन का मूल्यांकन मानव वाहिका (5 पीए) के भीतर होने वाले यांत्रिक बलों के जवाब में सेरीन 1177 अवशेषों पर आरबीसी-एनओएस के फॉस्फोराइलेशन में अच्छी तरह से रिपोर्ट की गई वृद्धि को मापकर किया गया था।
हाल के साहित्य से पता चलता है कि आरबीसी-एनओएस प्रोटीन आरबीसी विकृति15,22,23 के विनियमन के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है, जो बदले में संकीर्ण केशिकाओं 24 के माध्यम से उनके पारित</s…
The authors have nothing to disclose.
एलके एक ऑस्ट्रेलियाई सरकार अनुसंधान प्रशिक्षण कार्यक्रम छात्रवृत्ति के समर्थन को स्वीकार करता है।
3,3′-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate | Sigma/Merck | D5637 | DAB |
Ammoniumchloride | Merck /Millipore | 101145 | NH4Cl |
Centrifuge 5427 R | Eppendorf | 5409000010 | |
Coverslips | VWR | 631-0147 | |
di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate | Merck /Millipore | 106580 | Na2HPO4. 2 H2O |
Disposable transfer pipettes | VWR | 612-6803 | |
Entellan | Merck /Millipore | 107961 | rapid mounting medium for microscopy |
Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK) | Hofmann | 642 | |
Glucose-Oxidase | Sigma/Merck | G2133 | |
Grease pencil | Dako | S 2002 | |
Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin−Peroxidase | Sigma/Merck | E-2886 | HRP |
Hydrochloric acid | Merck /Millipore | 109057 | HCl |
Hydrogen peroxide, 30% | Merck /Millipore | 107203 | H2O2 |
ImageJ Software | Freeware | ||
Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA) | RR Mechatronics | Ektacytometer instrument used for shearing | |
Methanol | Merck /Millipore | 106009 | |
Microscope slides | VWR | 630-1985 | |
Nickel(II)-sulfate Hexahydrate | Sigma/Merck | N4882 | NiSO4.6H2O |
Normal Goat serum | Agilent/DAKO | X0907 | NGS |
Paraformaldehyde | Merck /Millipore | 818715 | PFA |
Pipettes Eppendorf Reference 2 | VWR | 613-5836/ 613-5839 | |
Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177) | Merck/Millipore | 07-428-I | Primary Antibody |
Reaction tubes, 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
Secondary Antibody goat anti rabbit | Agilent/DAKO | E0432 | Secondary Antibody |
Skim milk powder | Bio-Rad | 170-6404 | |
Sodium chloride | Merck /Millipore | 106404 | NaCl |
Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck /Millipore | 106346 | NaH2PO4.H2O |
Sodium hydroxide, 1 M | Merck /Millipore | 150706 | NaOH |
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Merck /Millipore | 108382 | Tris |
Trypsin | Sigma/Merck | T7409 | |
Tween20 | Merck /Millipore | 822184 | |
Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F | Merck /Millipore | WHA1825047 | |
Xylol | VWR Chemicals | 2,89,73,465 | |
ß-D-Glucose monohydrate | Merck /Millipore | 14431-43-7 |