적혈구 단백질의 동적 변화에 대한 면역염색 기반 검출
Summary
적출된 적혈구의 단백질 활성화의 동적 변화를 포착하는 것은 추후 평가를 위해 급성 자극에 대한 동적 변화를 보존하는 것과 같은 방법론적 문제를 제기합니다. 제시된 프로토콜은 관련 단백질 변화의 보존 및 분석과 후속 검출을 가능하게 하는 샘플 준비 및 염색 기술을 설명합니다.
Abstract
적혈구(RBC) 단백질의 항체 표지는 전체 단백질 함량의 변화 또는 단백질 활성화 상태의 급격한 변화를 감지하기 위해 일반적으로 사용되는 반정량적 방법입니다. 적혈구 치료의 평가, 특정 질병 상태의 차이 특성화 및 세포 일관성 설명을 용이하게 합니다. 급격하게 변형된 단백질 활성화(예: 기계 형질도입을 통해)를 검출하려면 일시적인 단백질 변형을 보존하기 위해 적절한 샘플 준비가 필요합니다. 기본 원리는 특정 1차 항체의 초기 결합을 가능하게 하기 위해 원하는 RBC 단백질의 표적 결합 부위를 고정화하는 것을 포함한다. 샘플은 상응하는 1차 항체에 대한 2차 항체의 결합을 위한 최적 조건을 보장하기 위해 추가 처리됩니다. 비형광 2차 항체를 선택하려면 비오틴-아비딘 커플링과 염색을 위한 3,3-디아미노벤지딘-테트라히드로클로라이드(DAB)의 적용을 포함한 추가 처리가 필요하며, 이는 산화를 멈추고 염색 강도를 적시에 제어하기 위해 현미경으로 실시간으로 제어해야 합니다. 염색 강도 검출을 위해 표준 광학 현미경을 사용하여 이미지를 촬영합니다. 이 프로토콜의 변형에서, 플루오레세인-접합된 2차 항체가 대신 적용될 수 있으며, 이는 추가 개발 단계가 필요하지 않다는 이점을 갖는다. 그러나 이 절차에서는 염색 검출을 위해 현미경에 부착된 형광 대물렌즈가 필요합니다. 이러한 방법의 반정량적 특성을 감안할 때, 비특이적 항체 반응 및 배경 신호를 설명하기 위해 몇 가지 대조 염색을 제공하는 것이 필수적입니다. 여기에서는 염색 프로토콜과 해당 분석 프로세스를 모두 제시하여 다양한 염색 기술의 각 결과와 장점을 비교하고 논의합니다.
Introduction
적혈구(RBC)는 70일에서 140일 동안 심혈관계를 통과하며, 평균 적혈구 연령은 약 115일이다 1,2. 노화 또는 손상된 적혈구는 대식세포에 의해 구동되는 효율적인 제거 과정인 적혈구증가증에 의해 순환계에서 제거된다3. 이러한 세포의 미리 결정된 수명은 분화와 성숙 과정에서 핵, 미토콘드리아, 리보솜을 포함한 세포 소기관을 포기한 결과 중 하나이다4. 따라서 순환하는 적혈구에는 새로운 단백질의 합성을 방해하는 번역 기계가 없다3. 따라서 기존 단백질에 대한 동적 번역 후 변형은 적혈구에 작용하는 세포외 및 세포내 스트레스 요인에 대한 반응으로 급성, 생화학적 조절의 유일한 실행 가능한 메커니즘을 나타냅니다5.
기계적 힘은 적혈구 내에서 생화학적 경로의 활성화 또는 조절을 유발하는 주요 세포외 신호인 것으로 보입니다. RBC 막에서 기계 감응성 단백질인 Piezo1의 발견은 6 이 세포에서 기계적으로 활성화된 신호 전달을 조사하는 여러 연구 라인에 영감을 주었습니다 7. 예를 들어, 최근의 발전은 적혈구의 물리적 특성이 번역 후 인산화 및 유비퀴틴화(ubiquitination)9를 포함하는 단백질8의 급성 및 동적 변화에 의해 능동적으로 조절된다는 것을 보여주었다. 이러한 정상적인 변형은 특정 질병 9,10,11에서 다르기 때문에 특히 기계 생물학적 과정과 관련하여 RBC 단백질의 활성화 상태를 결정하는 것이 과학적이고 임상적으로 중요한 것으로 보입니다.
RBC 단백질 활성화 상태의 급격한 변화를 결정하는 것은 몇 가지 방법론적 문제를 제기합니다. 예를 들어, 추후 분석을 위해 RBC 샘플을 보관하려면 번역 후 변형이 내구성이 없기 때문에 변형된 RBC 단백질의 보존이 필요합니다. 또한, 전통적인 단백질 검출 방법(예: 웨스턴 블로팅)은 적혈구에서 표준화하기가 매우 어려운데, 이는 헤모글로빈에 비해 단백질 함량이 낮기 때문이며, 헤모글로빈은 이러한 세포에서 단백질 함량의 ~98%를 차지한다12. 따라서 화학적으로 보존된 적혈구의 항체 기반 염색은 산화질소 합성효소(RBC-NOS)의 적혈구 특이적 동형과 같은 중요한 적혈구 단백질의 급성 변형을 조사할 때 선택되는 방법이었습니다13,14. RBC-NOS는 효소적으로 산화질소(NO)를 생성하는 것으로 나타났으며, 이는 RBC 변형성을 포함한 필수 RBC 특성에 필수적인 것으로 보인다15,16,17. RBC-NOS의 번역 후 변형은 촉매 효소 활성을 조절하며, 세린 1177 잔기의 인산화는 효소 활성을 증가시키는 것으로 설명되는 반면, 잔기 세린 114 또는 트레오닌 495의 인산화는 RBC-NOS 활성 감소와 관련이 있습니다18,19.
총체적으로, RBC 단백질의 일시적인 변형은 중요한 세포 기능에 기여하며, 이러한 변형된 단백질의 검출을 가능하게 하는 표준화된 프로토콜은 높은 가치가 있습니다. 여기에서는 RBC-NOS 단백질 활성화의 검출을 용이하게 하기 위해 특정 항체를 활용하는 두 가지 별개의 프로토콜을 제시하고 데이터 분석 및 해석을 위한 권장 사항에 대해 논의합니다.
기술된 프로토콜의 성능은 인간 맥관 구조(5 Pa) 내에서 발생하는 것을 반영하는 기계적 힘에 대한 반응으로 세린 1177 잔기에서 RBC-NOS의 인산화 증가의 잘 보고된 증가를 측정함으로써 평가되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
최근 문헌은 RBC-NOS 단백질 이 RBC 변형성 15,22,23의 조절에 결정적으로 중요하다는 것을 강력히 시사하며, 이는 차례로 좁은 모세혈관을 통한 통과를 용이하게 한다 24. 단백질 활성은 번역 후 단백질 변형, 특히 특정 잔기의 인산화에 크게 의존한다18. 관심의 초점은 RBC-NOS 단백질…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LK는 호주 정부 연구 훈련 프로그램 장학금의 지원을 인정합니다.
Materials
| 3,3′-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate | Sigma/Merck | D5637 | DAB |
| Ammoniumchloride | Merck /Millipore | 101145 | NH4Cl |
| Centrifuge 5427 R | Eppendorf | 5409000010 | |
| Coverslips | VWR | 631-0147 | |
| di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate | Merck /Millipore | 106580 | Na2HPO4. 2 H2O |
| Disposable transfer pipettes | VWR | 612-6803 | |
| Entellan | Merck /Millipore | 107961 | rapid mounting medium for microscopy |
| Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK) | Hofmann | 642 | |
| Glucose-Oxidase | Sigma/Merck | G2133 | |
| Grease pencil | Dako | S 2002 | |
| Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin−Peroxidase | Sigma/Merck | E-2886 | HRP |
| Hydrochloric acid | Merck /Millipore | 109057 | HCl |
| Hydrogen peroxide, 30% | Merck /Millipore | 107203 | H2O2 |
| ImageJ Software | Freeware | ||
| Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA) | RR Mechatronics | Ektacytometer instrument used for shearing | |
| Methanol | Merck /Millipore | 106009 | |
| Microscope slides | VWR | 630-1985 | |
| Nickel(II)-sulfate Hexahydrate | Sigma/Merck | N4882 | NiSO4.6H2O |
| Normal Goat serum | Agilent/DAKO | X0907 | NGS |
| Paraformaldehyde | Merck /Millipore | 818715 | PFA |
| Pipettes Eppendorf Reference 2 | VWR | 613-5836/ 613-5839 | |
| Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177) | Merck/Millipore | 07-428-I | Primary Antibody |
| Reaction tubes, 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
| Secondary Antibody goat anti rabbit | Agilent/DAKO | E0432 | Secondary Antibody |
| Skim milk powder | Bio-Rad | 170-6404 | |
| Sodium chloride | Merck /Millipore | 106404 | NaCl |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck /Millipore | 106346 | NaH2PO4.H2O |
| Sodium hydroxide, 1 M | Merck /Millipore | 150706 | NaOH |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Merck /Millipore | 108382 | Tris |
| Trypsin | Sigma/Merck | T7409 | |
| Tween20 | Merck /Millipore | 822184 | |
| Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F | Merck /Millipore | WHA1825047 | |
| Xylol | VWR Chemicals | 2,89,73,465 | |
| ß-D-Glucose monohydrate | Merck /Millipore | 14431-43-7 |
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