Detección de alteraciones dinámicas en las proteínas de los glóbulos rojos basada en inmunotinción
Summary
La captura de los cambios dinámicos en la activación proteica de los glóbulos rojos enucleados plantea desafíos metodológicos, como la preservación de los cambios dinámicos en los estímulos agudos para su posterior evaluación. El protocolo presentado describe las técnicas de preparación y tinción de muestras que permiten la preservación y el análisis de los cambios proteicos relevantes y su posterior detección.
Abstract
El marcaje de anticuerpos de las proteínas de los glóbulos rojos (RBC) es un método semicuantitativo de uso común para detectar cambios en el contenido general de proteínas o alteraciones agudas en los estados de activación de las proteínas. Facilita la evaluación de los tratamientos con hematíes, la caracterización de las diferencias en ciertos estados de la enfermedad y la descripción de las coherencias celulares. La detección de la activación de proteínas agudamente alterada (por ejemplo, a través de la mecanotransducción) requiere una preparación adecuada de la muestra para preservar las modificaciones proteicas que de otro modo serían temporales. El principio básico incluye la inmovilización de los sitios de unión diana de las proteínas glóbulos rojos deseadas para permitir la unión inicial de anticuerpos primarios específicos. La muestra se procesa posteriormente para garantizar las condiciones óptimas para la unión del anticuerpo secundario al anticuerpo primario correspondiente. La selección de anticuerpos secundarios no fluorescentes requiere un tratamiento adicional, incluido el acoplamiento biotina-avidina y la aplicación de 3,3-diaminobencidina-tetraclorhidrato (DAB) para desarrollar la tinción, que debe controlarse en tiempo real bajo un microscopio para detener la oxidación y, por lo tanto, la intensidad de la tinción, a tiempo. Para la detección de la intensidad de las manchas, las imágenes se toman con un microscopio óptico estándar. En una modificación de este protocolo, se puede aplicar en su lugar un anticuerpo secundario conjugado con fluoresceína, lo que tiene la ventaja de que no es necesario ningún paso de desarrollo adicional. Este procedimiento, sin embargo, requiere un objetivo de fluorescencia conectado a un microscopio para la detección de manchas. Dada la naturaleza semicuantitativa de estos métodos, es imperativo proporcionar varias tinciones de control para tener en cuenta las reacciones de anticuerpos no específicas y las señales de fondo. Aquí, presentamos tanto los protocolos de tinción como los procesos analíticos correspondientes para comparar y discutir los respectivos resultados y ventajas de las diferentes técnicas de tinción.
Introduction
Los glóbulos rojos (RBC) atraviesan el sistema cardiovascular durante 70 a 140 días, con una edad media de los glóbulos rojos de aproximadamente 115 días 1,2. Los glóbulos rojos senescentes o dañados son eliminados de la circulación por eritrofagocitosis, un proceso de limpieza eficiente impulsado por los macrófagos3. La vida útil predeterminada de estas células es una consecuencia de la entrega de los orgánulos celulares, incluidos el núcleo, las mitocondrias y los ribosomas, durante la diferenciacióny la maduración. Por lo tanto, los glóbulos rojos circulantes están desprovistos de una maquinaria de traducción, lo que impide la síntesis de nuevas proteínas3. De ello se deduce que las modificaciones dinámicas postraduccionales de las proteínas existentes representan el único mecanismo viable de regulación bioquímica aguda en respuesta a los factores estresantes extracelulares e intracelulares que actúan sobre los glóbulos rojos5.
Las fuerzas mecánicas parecen ser las principales señales extracelulares que causan la activación o modulación de las vías bioquímicas dentro de los glóbulos rojos. El descubrimiento de la proteína mecanosensible, Piezo1, en las membranas de los glóbulos rojos6 inspiró varias líneas de investigación que investigan la señalización activada mecánicamente en estas células7. Por ejemplo, avances recientes han demostrado que las propiedades físicas de los glóbulos rojos están reguladas activamente por cambios agudos y dinámicos de las proteínas8, que incluyen la fosforilación postraduccional y la ubiquitinación9. Dado que estas modificaciones normales difieren en ciertas enfermedades 9,10,11, parece ser de interés científico y clínico determinar el estado de activación de las proteínas de los glóbulos rojos, específicamente en relación con los procesos mecanobiológicos.
La determinación de los cambios agudos en los estados de activación de la proteína de los glóbulos rojos plantea algunos desafíos metodológicos. Por ejemplo, el almacenamiento de muestras de glóbulos rojos para su posterior análisis requiere la preservación de las proteínas de glóbulos rojos modificadas, ya que las modificaciones postraduccionales no son duraderas. Además, los métodos clásicos de detección de proteínas (p. ej., Western blot) son notoriamente difíciles de estandarizar en los glóbulos rojos debido a la baja abundancia de proteínas en relación con la hemoglobina, que representa ~98% del contenido de proteínas en estas células12. Por lo tanto, la tinción basada en anticuerpos de los glóbulos rojos conservados químicamente ha sido el método de elección cuando se investigan modificaciones agudas de importantes proteínas de los glóbulos rojos, como la isoforma específica de los glóbulos rojos de la óxido nítrico sintasa (RBC-NOS)13,14. Se ha demostrado que RBC-NOS produce enzimáticamente óxido nítrico (NO), que parece indispensable para las propiedades esenciales de los glóbulos rojos, incluida la deformabilidad de los glóbulos rojos15,16,17. Las modificaciones postraduccionales de los glóbulos rojos-NOS regulan la actividad catalítica de las enzimas, dándose como resultado que la fosforilación del residuo de serina 1177 aumenta la actividad enzimática, mientras que la fosforilación de los residuos serina 114 o treonina 495 se ha relacionado con una disminución de la actividad de los glóbulos rojos18,19.
En conjunto, las modificaciones temporales de las proteínas de los glóbulos rojos contribuyen a una función celular importante, y los protocolos estandarizados que permiten la detección de estas proteínas modificadas son de gran valor. Aquí, presentamos dos protocolos distintos que explotan anticuerpos específicos para facilitar la detección de la activación de la proteína RBC-NOS, y discutimos las recomendaciones para el análisis y la interpretación de datos.
El rendimiento de los protocolos descritos se evaluó midiendo el aumento bien informado en la fosforilación de RBC-NOS en el residuo de serina 1177 en respuesta a fuerzas mecánicas que reflejan las que ocurren dentro de la vasculatura humana (5 Pa).
Protocol
Representative Results
Discussion
La literatura reciente sugiere que la proteína RBC-NOS es de crucial importancia para la regulación de la deformabilidad de los glóbulos rojos 15,22,23, lo que a su vez facilita su paso a través de capilares estrechos 24. La actividad proteica depende en gran medida de las modificaciones proteicas postraduccionales, en particular de la fosforilación de ciertos residuos18. El …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LK agradece el apoyo de una beca del Programa de Capacitación en Investigación del Gobierno de Australia.
Materials
| 3,3′-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate | Sigma/Merck | D5637 | DAB |
| Ammoniumchloride | Merck /Millipore | 101145 | NH4Cl |
| Centrifuge 5427 R | Eppendorf | 5409000010 | |
| Coverslips | VWR | 631-0147 | |
| di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate | Merck /Millipore | 106580 | Na2HPO4. 2 H2O |
| Disposable transfer pipettes | VWR | 612-6803 | |
| Entellan | Merck /Millipore | 107961 | rapid mounting medium for microscopy |
| Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK) | Hofmann | 642 | |
| Glucose-Oxidase | Sigma/Merck | G2133 | |
| Grease pencil | Dako | S 2002 | |
| Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin−Peroxidase | Sigma/Merck | E-2886 | HRP |
| Hydrochloric acid | Merck /Millipore | 109057 | HCl |
| Hydrogen peroxide, 30% | Merck /Millipore | 107203 | H2O2 |
| ImageJ Software | Freeware | ||
| Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA) | RR Mechatronics | Ektacytometer instrument used for shearing | |
| Methanol | Merck /Millipore | 106009 | |
| Microscope slides | VWR | 630-1985 | |
| Nickel(II)-sulfate Hexahydrate | Sigma/Merck | N4882 | NiSO4.6H2O |
| Normal Goat serum | Agilent/DAKO | X0907 | NGS |
| Paraformaldehyde | Merck /Millipore | 818715 | PFA |
| Pipettes Eppendorf Reference 2 | VWR | 613-5836/ 613-5839 | |
| Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177) | Merck/Millipore | 07-428-I | Primary Antibody |
| Reaction tubes, 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
| Secondary Antibody goat anti rabbit | Agilent/DAKO | E0432 | Secondary Antibody |
| Skim milk powder | Bio-Rad | 170-6404 | |
| Sodium chloride | Merck /Millipore | 106404 | NaCl |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck /Millipore | 106346 | NaH2PO4.H2O |
| Sodium hydroxide, 1 M | Merck /Millipore | 150706 | NaOH |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Merck /Millipore | 108382 | Tris |
| Trypsin | Sigma/Merck | T7409 | |
| Tween20 | Merck /Millipore | 822184 | |
| Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F | Merck /Millipore | WHA1825047 | |
| Xylol | VWR Chemicals | 2,89,73,465 | |
| ß-D-Glucose monohydrate | Merck /Millipore | 14431-43-7 |
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