Summary
在这里,我们展示了一种非侵入性心脏医疗设备收缩力评估方法,该方法使用2D人诱导多能干细胞衍生心肌细胞(hiPSC-CM)单层,接种在柔性基板上,并结合基于视频的显微镜。该工具将可用于心脏电生理学装置收缩特性的 体外 评估。
Abstract
人诱导多能干细胞衍生心肌细胞(hiPSC-CMs)目前正在探索多种 体外 应用,并已用于监管提交。在这里,我们将它们的使用扩展到心脏医疗设备的安全性或性能评估。我们开发了一种新方法来评估心脏医疗设备在基于柔性细胞外基质(ECM)的水凝胶底物上稳定收缩2D hiPSC-CMs单层时的收缩性能。该工具能够使用标准实验室设备量化心脏电生理学设备信号对人体心脏功能的影响(例如收缩特性)。将2D hiPSC-CM单层在48孔形式的柔性水凝胶底物上培养2-4天。
将hiPSC-CM暴露于标准心脏收缩力调节(CCM)医疗设备电信号中,并与对照(即仅起搏)hiPSC-CM进行比较。通过基于像素位移的视频检测分析量化了二维hiPSC-CMs的基线收缩性能。接种在柔性水凝胶底物上的CCM刺激的2D hiPSC-CMs相对于基线(即CCM刺激前)表现出显着增强的收缩性能,包括增加的峰值收缩幅度和加速的收缩和松弛动力学。此外,柔性水凝胶底物的利用能够在健康和患病的hiPSC-CM中多路复用基于视频的心脏兴奋收缩耦合读数(即电生理学,钙处理和收缩)。准确检测和量化心脏电生理信号对人体心脏收缩的影响对于心脏医疗器械的开发、优化和去风险至关重要。该方法能够对心脏合胞体的收缩特性进行稳健的可视化和量化,这对于非临床心脏医疗器械的安全性或有效性测试应该是有价值的。本文详细介绍了生成2D hiPSC-CM水凝胶底物单层的方法。
Introduction
随着美国人口老龄化,心力衰竭患者的数量持续上升,直接医疗费用也随之上升1,2。迫切需要开发治疗心力衰竭的新疗法和创新的非临床方法来测试这些疗法。人诱导多能干细胞衍生心肌细胞(hiPSC-CMs)已被提议作为体外工具,以帮助治疗开发过程,并已用于监管提交3,4。然而,由于在标准刚性2D培养条件(即常规组织培养塑料或玻璃)中镀膜时缺乏强大的收缩性能,它们的广泛使用在收缩性研究中受到限制5,6,7,8。我们之前证明了在柔性水凝胶基质上电镀分离的单个hiPSC-CMs以产生强大的可见收缩性能的实用性9。我们发现分离的hiPSC-CMs与新鲜分离的成年兔心室心肌细胞具有相当的收缩特性。此外,我们证明了这种方法在评估对药物的收缩反应中的实用性7。此外,其他研究已将该技术应用于基础科学和疾病建模的机制评估10,11,12。在这里,该方法已扩展到2D hiPSC-CM单层,并证明了其在体外评估生理相关的心脏收缩力调节(CCM)医疗设备电信号的实用性。
CCM是一种心内心力衰竭疗法,其中非兴奋性电生理信号在心动周期的绝对不应期传递到心肌13,14。缺乏在人心脏细胞模型中评估CCM的可重复方法。以前的工作已经采用了各种心脏细胞模型来评估CCM收缩反应。我们在体外证明,新鲜分离的兔心室心肌细胞通过钙的瞬时增加和收缩幅度15对CCM刺激做出反应。另一项针对分离犬室心肌细胞的研究表明,CCM 诱导的细胞内钙瞬时振幅增强16。然而,大多数CCM研究都使用了离体和体内动物制剂。这些研究很难相互关联,因为它们应用了各种CCM脉冲参数和物种17。一项孤立的兔状模型的研究表明CCM诱导的收缩力增加8,18,一系列全心研究表明CCM诱导的收缩功能增强19,20,21。这些研究提供了重要的机制见解。然而,体外心脏EP收缩研究(包括CCM)缺乏可重复的人体模型。为此,我们开发了几种2D和3D hiPSC模型,并以参数依赖的方式证明了CCM诱导的收缩性能增强。此外,已发现CCM诱导的正性肌力作用部分由神经元输入和β-肾上腺素能信号传导介导8,17,22。尽管如此,还需要更多地了解CCM治疗的机制,并且利用收缩的人心肌细胞可以帮助实现这一结果。因此,非常需要开发人类非临床工具来评估新型CCM设备和信号,加快监管过程,减轻动物模型的负担,并帮助设备开发人员做出决策8,17,23,24。重要的是开发简单的、自己动手的方案,这些方案可以转移到任何实验室,并使用标准设备和低细胞要求来降低成本。该方法阐明了CCM刺激对人心肌细胞功能的影响,并为CCM的安全性或有效性提供了重要的见解17。在这里,我们描述了在柔性水凝胶底物上生成2D hiPSC-CM单层的方法,以产生标准化的非临床工具,以量化急性心脏电生理学医疗设备(即CCM)在健康和疾病中的收缩反应。
Protocol
1. 板和培养基的制备
注意:典型的基于细胞外基质(ECM)的水凝胶等分试样在储存在-20°C的无菌1.5 mL管中为~20μL。
- 在无菌组织培养罩中,通过将 2 mL 0.1% 明胶(材料表)转移到每个孔中来制备无菌 6 孔板。将盖子放在6孔板上,并让包衣板在37°C下孵育至少1小时。
- 在将hiPSC-CMs接种在柔性水凝胶底物上的前一天,在冰箱中的冰上解冻水凝胶(材料表)。
- 通过混合 500 mL RPMI 1640、10 mL 50x B-27 补充剂和 5 mL 青霉素-链霉素9 来制备心肌细胞培养基(材料表)。
2. 冷冻保存的hiPSC-CMs的接种
- 在将hiPSC-CMs接种在柔性水凝胶底物上的两天前,将hiPSC-CMs预板在0.1%明胶包被的无菌6孔板上。使用标准解冻方案解冻hiPSC-CMs9,25。
- 然后,根据制造商的说明(图1A)26,每孔板1,500,000个总hiPSC-CM(材料表)。
- 将hiPSC-CMs在标准心肌细胞培养基中培养2-4天,以使hiPSC-CMs从37°C和5%CO2的冷冻保存中恢复。每48小时用100%心肌细胞培养基刷新用过的培养基。
3. 预镀 hiPSC-CM 的解离和计数
- 解离前检查 hiPSC-CM 的状态。评估 hiPSC-CM 的健康状况,确保存活和稳定跳动。
注意:hiPSC-CM 群体的纯度很重要(例如,>90% 心肌肌钙蛋白 T)7。建议使用心肌细胞选择方法(例如,代谢选择或分选)以减少非心肌细胞25,26对水凝胶底物的破坏。 - 用每孔 4 mL 不含 CaCl2 或 MgCl2 的 D-PBS 洗涤 hiPSC-CMs 2x(材料表)。吸出D-PBS,向每个孔中加入1mL室温解离试剂,然后在37°C下孵育15分钟。
- 将 10 mL 心肌细胞培养基加入无菌 15 mL 锥形管中。
- 用 1,000 μL 移液器将 hiPSC-CM 从 6 孔板中解离(图 1B)。将细胞悬液加入15 mL锥形管26中。
- 用 1 mL 新鲜心肌细胞培养基冲洗孔以收集任何残留的 hiPSC-CM,并将它们添加到 15 mL 锥形管中。将锥形管的最终体积降至 15 mL。
- 离心5分钟(200× 克)。取出上清液至1 mL标记。将细胞重悬于心肌细胞培养基中至终体积为 5 mL。
- 使用手动或自动细胞计数器计数hiPSC-CM。
- 在制备柔性水凝胶底物的同时,在室温下孵育hiPSC-CM悬浮液(最多30分钟)。
4. 柔性水凝胶底物的制备
- 准备 1 μL 的 20 μL 移液器、20 μL 移液器吸头(例如 20 μL)和无菌 48 孔玻璃底板。确保在制作水凝胶基材之前准备好秒表/计时器。
- 在无菌组织培养罩中,通过轻轻敲击试管来混合基于ECM的水凝胶底物,并立即将其放回冰上。
- 然后,在第一个水凝胶基材铺板之前立即启动秒表/计时器 - 这是时间零。
- 上下移取 1 μL 水凝胶底物 ~3x 以冷却移液器吸头。将~1μL未稀释的水凝胶底物水平施加到48孔板的每个孔的底部(图1C,图2A和图3A),将移液器保持在45°角。在每个孔中以相同的方向将所有水凝胶底物铺成相同的方向(图2和图3),以帮助在以40倍放大倍数7,9,17,27进行实验时识别底物。
注意:每~1μL线是一个水凝胶底物(图3)。通常,准备48个孔需要~5分钟。使用水平倾斜的微孔板支架(例如,30°)可以更好地观察孔底部和水凝胶基质。一定要走遍井的整个长度(即从左到右)。短水凝胶基材可能太厚,从而降低底物的稳定性。不要让水凝胶底物在移液器吸头中干燥。如果发生这种情况,请快速切换到新提示,并立即继续。或者,也可以使用冷冻移液器吸头。基于ECM的水凝胶底物不在冰上时可能会快速聚合。建议一次准备几个孔(例如,10个)。此外,建议在模拟 48 孔板中练习。 - 将盖子放在48孔板上,并让水凝胶底物在室温下在无菌组织培养罩中孵育8-10分钟,然后再加入细胞(图2B)。
注意:遵守建议的孵育时间很重要。超过10分钟的孵育时间将导致硬性水凝胶底物并且没有明显的收缩。小于8分钟的孵育时间可能导致底物塌陷。 - 立即将 hiPSC-CM 直接滴入水凝胶底物上,使用 1,000 μL 移液器,在 ~200 μL 心肌细胞培养基的低培养基中,每孔放置 ~30,000 个活的 hiPSC-CM(图 2B 和图 3B)。
注意:此过程停止水凝胶底物聚合并确保hiPSC-CM位于基底7,9,17,27上。 - 将盖子放在平板上,让hiPSC-CMs在室温下不受干扰地在无菌组织培养罩中孵育10-15分钟(图2C),以使hiPSC-CMs粘附在水凝胶底物上。
- 向每个孔中轻轻加入~100μL新鲜心肌细胞培养基(最终体积:每孔~300μL)。将盖子放在板上,并转移到37°C,5%CO 2的培养箱中2-4 天。在进行收缩实验之前,每24小时刷新一次100%培养基。
注意:目视检查hiPSC-CM的正确形态;电镀后,hiPSC-CMs应立即呈现圆形(图3B)。到接种后第 2 天,将观察到融合的 2D hiPSC-CM 单层合胞体(图 3C)(补充视频 S1),具有强烈的可见收缩(补充视频 S2)。
5. 收缩记录和分析
- 制备CCM测定培养基,这是含有以下内容(以mmol/L为单位)的Tyrode溶液:CaCl2 0.5,NaCl 134,KCl 5.4,MgCl2 1,葡萄糖10和HEPES 10,pH值用NaOH调节至7.4,并在水浴中平衡至37°C。
注意:次最大细胞外钙(0.5mM)用于增强CCM测定窗口。 - 打开显微镜和环境控制室,使其平衡至37°C和5%CO2。
- 从 48 孔板中取出心肌细胞培养基,并用 600 μL CCM 测定培养基轻轻冲洗每个孔两次。
- 每孔加入 300 μL CCM 测定培养基,并将 48 孔板放在环境控制室的显微镜上。插入电极,并平衡细胞5分钟。
- 使用基于视频的显微镜记录收缩视频。打开视频录制软件,设置100帧/秒的帧速率。选择靠近 hiPSC-CM 单层中心的感兴趣区域 (ROI)。
注意:不要选择靠近hiPSC-CM单层边缘的ROI,因为这对于收缩记录可能不稳定。 - 然后,用商用脉冲发生器(材料表)场刺激细胞,以电起搏2D hiPSC-CM单层。使用基线脉冲参数(例如,单相方波起搏脉冲,2 ms 刺激脉冲持续时间为 ~14 V/cm)在 1 Hz 下以 1.5 倍阈值起搏 hiPSC-CMs17。
- 记录基线,仅起搏(即CCM之前)(图1D)收缩视频至少为5拍17,28。
- 然后,用实验电信号刺激hiPSC-CM单层(图1D)。要遵循此协议,请使用标准CCM刺激参数:两个对称双相脉冲,相位持续时间为 5.14 ms(总持续时间为20.56 ms),~28 V/cm (相位幅度), 零相间间隔和30 ms延迟 (即,从起搏脉冲结束到CCM脉冲开始的时间)(图1D)29,30,并录制 CCM 诱导的收缩视频,至少 5 拍。
- 关闭 CCM 信号,用基线起搏脉冲刺激,并记录恢复期(即 CCM 之后)的收缩视频,至少 5 次。
- 使用标准收缩软件自动分析收缩视频并量化关键收缩特性(例如,收缩幅度、收缩斜率、松弛斜率、达到峰值的时间、到基线的时间 90% 和收缩持续时间 50%)7,17,31,32。
- 在柔性水凝胶基板上使用2D hiPSC-CMs在底物上铺板后第2-14天进行收缩实验。
Representative Results
本协议中描述的是一种简单,强大的工具,可在柔性水凝胶底物上产生明显收缩的2D hiPSC-CM单层。收缩性能的测量是通过基于视频的记录和收缩性分析软件完成的。这样可以量化心肌细胞收缩力的关键参数,包括收缩幅度、收缩斜率、松弛斜率、达到峰值的时间、达到基线的时间 90% 和收缩持续时间 50%。该模型用于表征来自各种“健康”供体的hiPSC-CMs(图4)的基线收缩特性,并且可以扩展到心脏电生理学医疗设备信号(即CCM)的评估。标准CCM刺激参数的应用(图1D)29,30 导致 体外 收缩性能增强(图5 和 表1)17。
我们进一步证明,该方法可用于评估在有和没有CCM刺激的情况下调节细胞外钙浓度对人体收缩特性的影响(图6)17。观察到收缩的预期基线钙依赖性7,17,以及CCM诱导的心肌细胞单层水平钙敏感性的增加。此外,对β-肾上腺素能信号通路的药理学询问(图7)显示,CCM诱导的正性肌力作用部分由β-肾上腺素能信号传导介导17。此外,该工具可以扩展到患者特异性疾病心肌细胞,包括扩张型心肌病(DCM)33,34,35(图8),以了解CCM在疾病状态背景下的影响;事实上,在这里测试的CCM“剂量”下观察到增强的收缩幅度和加速的收缩和松弛动力学(图8)。虽然我们的实验室中有一个CCM模拟设备,但这里使用的方法并不是特定于该系统的,可以应用于其他心脏电生理设备。
图 1:2D hiPSC-CM 体外 CCM 模型的示意图摘要。 (A)将hiPSC-CMs以单层形式预铺在明胶(0.1%)包被的6孔板上。(B)培养2天后,将hiPSC-CMs解离并准备在柔性水凝胶基质上接种。(C) 将分离的 hiPSC-CM 高密度接种在以 48 孔形式排列的水凝胶底物上(左),并在 (0.5 mM) 细胞外钙 Tyrode 溶液中测定(右)。(D)商用脉冲发生器和标准临床CCM脉冲参数29,30 (右)用于刺激hiPSC-CMs;通过基于视频的分析评估心脏功能(左)。(E)CCM之前(基线:5 V),CCM期间(CCM:10 V)和CCM之后(恢复:5 V)的代表性收缩记录。该图转载自Feaster等人17。缩写:hiPSC-CM = 人诱导的多能干细胞衍生心肌细胞;CCM = 心脏收缩力调节。 请点击此处查看此图的大图。
图 2:柔性水凝胶基材电镀和接种示意图。 (A)将完全解冻,未稀释的基于ECM的水凝胶底物施加到无菌48孔板(左图),每孔1μL水凝胶底物(右图)。(B)允许水凝胶底物在室温下孵育8-10分钟(右图),然后将高密度hiPSC-CMs接种在低介质体积(~200μL)(左图)。(C)孵育10-15分钟后,将培养基加入每个孔(左图),并将板移至标准组织培养箱(右图)。缩写:ECM = 细胞外基质,hiPSC-CM = 人诱导多能干细胞来源心肌细胞;RT = 室温。请点击此处查看此图的大图。
图3:基于细胞外基质的水凝胶底物 。 (A)在将底物施加到孔后立即将代表性水凝胶底物(无细胞)置于48孔玻璃底板的一个孔中。(B)接种hiPSC-CMs后的时间0。(C)接种hiPSC-CMs后24小时的时间。该面板转载自 Feaster et al.17。白色箭头表示水凝胶基材的边缘,4倍放大倍率。比例尺 = 1 毫米。缩写:hiPSC-CM = 人诱导的多能干细胞来源的心肌细胞。 请点击此处查看此图的大图。
图 4:2D hiPSC-CM 单层收缩特性的表征。 (A) 以 1 Hz (5 V) 起搏的 2D hiPSC-CM 的代表性收缩记录。(B)描述一个收缩周期的代表性收缩轨迹。(C) 摘要条形图。数据平均值为 SEM ± n = 18。缩写:hiPSC-CM = 人诱导的多能干细胞来源的心肌细胞。请点击此处查看此图的大图。
图 5:CCM 对 2D hiPSC-CM 收缩性能的急性影响。 (A)CCM前(5 V),CCM期间(10 V)和CCM后(5 V)的代表收缩记录。(B)直接影响的代表性收缩痕迹(即CCM前的最后一次搏动,第一次CCM搏动和CCM后的第一个搏动,用+表示)。(C)直接影响的摘要条形图。百分比变化,数据是平均值± SEM. n = 23。*p < 0.05, **p < 0.01, ****p < 0.001, ****p < 0.0001.该图转载自Feaster等人17。缩写:hiPSC-CM = 人诱导的多能干细胞衍生心肌细胞;CCM = 心脏收缩力调节。请点击此处查看此图的大图。
图6:细胞外钙调节对CCM反应的影响。 (A)CCM前(5V)、CCM(10V)和CCM(5V)后每组直接影响的代表性收缩痕迹;将hiPSC-CMs暴露于0.25-2mM的细胞外钙(Cao)浓度增加。(乙-四)转换数据(sigmoidal)以引导眼睛,证明CCM对收缩特性(即振幅和动力学)的钙敏感性的影响(山坡= 1.0)。n = 每组 6-8 个。该图转载自Feaster等人17。缩写:hiPSC-CM = 人诱导的多能干细胞衍生心肌细胞;CCM = 心脏收缩力调节。 请点击此处查看此图的大图。
图7:药理学挑战。CCM (5 V)、CCM 期间 (10 V) 和 CCM (5V) 之后每组的代表性收缩轨迹;用(A)载体或(B)美托洛尔(2μM)预处理hiPSC-CMs。(中,四)每个条件的摘要条形图。百分比变化,数据是平均± SEM.n = 10 每组。*p < 0.05, **p < 0.01, ****p < 0.001, ****p < 0.0001. 该图转载自Feaster等人17。缩写:hiPSC-CM = 人诱导的多能干细胞衍生心肌细胞;CCM = 心脏收缩力调节。请点击此处查看此图的大图。
图8:CCM对患病2D hiPSC-CMs收缩特性的急性影响。 (A)DCM L35P,对照基线(6 V之前)和DCM L35P加CCM(10 V)的代表性收缩轨迹。(B) 摘要条形图。百分比变化,数据平均值± SEM. n = 3。*p < 0.05,**p < 0.01。缩写:hiPSC-CM = 人诱导的多能干细胞衍生心肌细胞;CCM = 心脏收缩力调节;DCM = 扩张型心肌病。请点击此处查看此图的大图。
补充视频S1:hiPSC-CMs在基于细胞基质的水凝胶上的延时摄影。 在柔性水凝胶底物上接种二维hiPSC-CMs;时间:0-90小时;48孔玻璃底板的一孔;4倍放大倍率。hiPSC-CMs形成水平单层合胞体(即从左到右)。比例尺 = 1 mm。 请点击此处下载此视频。
补充视频S2:基于细胞外基质的水凝胶上的hiPSC-CMs。 在柔性水凝胶底物上接种二维hiPSC-CMs;时间: ~24 小时;48孔玻璃底板的一孔;4倍放大倍率。hiPSC-CMs形成单层形态,并在电镀后~24小时表现出强烈的收缩。比例尺 = 1 毫米。该视频来自 Feaster 等人 17。 请点击此处下载此视频。
参数 | CCM | 后 |
波幅 | 16 ± 4%** | 4 ± 5% |
达到峰值的时间 50% | -20 ± 9%* | 7 ± 5% |
达到峰值的时间 90% | -22 ± 8%* | 6 ± 5% |
达到基线的时间 50% | -8 ± 5% | 4 ± 4% |
达到基线的时间 90% | -12 ± 6%* | 5 ± 5% |
收缩持续时间 10% | -13 ± 6% | 3 ± 5% |
收缩持续时间 50% | -6 ± 5 % | 3 ± 5% |
收缩持续时间 90% | 0 ± 5% | 3 ± 4% |
N | 23 | 23 |
表1:收缩性能。相对于CCM之前的百分比变化(5 V);数据是CCM(10 V)期间和CCM(5 V)期间每组所有节拍的平均± SEM。n = 23。*p < 0.05, **p < 0.01, ****p < 0.001, ****p < 0.0001。此表转载自 Feaster et al.17。
Discussion
本文概述的方案描述了一种使用商业试剂7,17在基于柔性细胞外基质(ECM)的水凝胶底物上产生稳健收缩的2D hiPSC-CM单层的方法。接种在柔性水凝胶底物上的hiPSC-CMs保持活力并具有增强的收缩性能7。该技术依赖于标准的实验室设备和能力7.协议中有几个关键步骤,包括与使用基于ECM的水凝胶底物有关的步骤,需要仔细注意细节。一个潜在的问题是培养基中存在血清。这可能导致 hiPSC-CM 形成网络(例如内皮/血管网络)而不是融合的单层片;因此,建议在建立柔性水凝胶hiPSC-CM单层期间(即第0天至第4天)使用无血清培养基。同样,由于操作员疲劳,一次制备过多的水凝胶底物可能会导致底物变差或不均匀。虽然快速工作很重要,但每种水凝胶底物的完整性至关重要。同样,应小心地接种hiPSC-CMs并更换培养基;这不应该强行完成。更换培养基时,应从孔的顶部边缘轻轻添加,以免破坏水凝胶底物或细胞。与标准 2D hiPSC-CM 培养物(即常规组织培养塑料或玻璃)一样,低密度电镀会导致不完全的单层形成。目视检查hiPSC-CMs以确认它们是否在水凝胶底物上并使用计时器以确保准确的定时非常重要。此外,根据ECM特性和底物制造商的说明,在水凝胶底物上培养2D hiPSC-CM单层超过14天可能会导致单层破碎。
必须考虑当前方法的几个限制。首先,该协议中使用的细胞来自商业hiPSC-CMs提供商,这些细胞形成电耦合细胞的合胞体。合胞体包含来自所有三种心脏亚型(即心室、心房和淋巴结)的 hiPSC-CM 混合物17。研究可能受益于亚型专属 hiPSC-CM 人群(即 100% 心室或 100% 心房)。其次,该方法仅使用hiPSC-CM,而非肌细胞,包括心脏成纤维细胞,内皮细胞和神经元,可以增强hiPSC-CM功能22,36。第三,2D hiPSC-CMs显示出相对未成熟的心肌细胞的几个特征,包括自发跳动,无定形形态和缺乏正性肌力反应8,37。第四,虽然该协议产生稳健收缩的2D hiPSC-CM单层,但功能增强的3D hiPSC-CM模型(如工程心脏组织(ECT))可能会导致在生理钙浓度8,38下增强CCM诱导的收缩反应。最后,此处描述的方案专为48孔格式而设计。然而,通过优化和自动化,这可以扩展到高通量形式(例如,96孔板或384孔板)。
目前hiPSC-CM研究的金标准是传统的刚性2D培养条件(即组织培养塑料或玻璃)。虽然对电生理学3和钙处理39研究有用,但传统方法导致最小的收缩性能5,6,7。因此,传统的刚性2D培养条件不适合评估CCM收缩效应8。功能增强型3D hiPSC-CM ECT 方法38在技术上具有挑战性,耗时,并且需要复杂的设备,而这些设备并非在每个实验室中都很容易获得。在该协议中,我们描述了一种简单的方法,该方法可在比3D ECT方法或长期常规2D方法更短的时间内产生稳健收缩的2D hiPSC-CM单层7,40,41。此外,这里使用的试剂是市售的,包括水凝胶底物和hiPSC-CMs,并且两者都具有相当大的批次间一致性。虽然我们使用可拆卸的铂丝电极(电极间距离:2.0 mm,宽度:1.0 mm),但各种电极材料和配置适用于体外CCM收缩评估8,15,17,18,22。同样,有多种自动化软件可用于分析收缩视频7,31,32。
大多数评估心脏医疗器械收缩力的非临床方法在很大程度上依赖于昂贵的 体内 动物模型(例如,狗或猪)和技术上具有挑战性的状肌条(例如,兔子)18。本文描述了一种人体 体外 模型来评估心脏电生理学医疗器械信号对收缩力的影响。该工具可以减少对动物研究的依赖,并可用于心脏电生理学装置收缩特性的 体外 评估。
Disclosures
本文反映了作者的观点,不应被解释为代表美国食品和药物管理局的观点或政策。提及商业产品、其来源或与此处报告的材料相关的使用不应被解释为卫生与公众服务部对此类产品的实际或暗示认可。作者声明对这项工作没有竞争利益。
Acknowledgments
这项工作得到了橡树岭科学与教育研究所通过美国能源部和美国食品和药物管理局之间的机构间协议管理的设备和放射健康中心研究参与计划的任命的部分支持。作者感谢Richard Gray,Trent Robertson和Anna Avila的建议和技术援助。该研究由美国食品和药物管理局科学与工程实验室办公室资助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.1% Gelatin | STEMCELL Technologies | 7903 | Pre-plating Culture Substrate |
48-well Plate | MatTek | P48G-1.5-6-F | Hydrogel Substrate hiPSC-CM Culture, Glass |
6-well Plate | Thermofisher | 140675 | hiPSC-CM Culture, Plastic |
B-27 Supplement, with insulin | Invitrogen | 17504-044 | Cardiomyocyte Media |
Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) | Fisher Scientific | c70-500 | Tyrode’s solution |
CellOPTIQ Platform and Software | Clyde Biosciences | Contraction Recording and Analysis | |
Conical tube 15 mL | Corning | 352099 | hiPSC-CM Dissociation |
Digital CMOS Camera | Hamamatsu | C11440-42U30 | Contraction Video Recording |
D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | Cell Wash |
Environmental Control Chamber | OKOLAB INC | H201-K-FRAME | Environmental Regulation |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1kg | Tyrode’s solution |
Hemocytometer | Fisher Scientific | 22-600-107 | hiPSC-CM Counting |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s solution |
iCell Cardiomyocytes Plating Medium | Fujifilm Cellular Dynamic, Inc. | M1001 | hiPSC-CM Plating Media |
iCell Cardiomyocytes2, 01434 | Fujifilm Cellular Dynamic, Inc. | R1017 | hiPSC-CMs |
Incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermofisher | 50116047 | Maintain hiPSC-CMs |
Inverted Microscope | Olympus | IX73 | Imaging hiPSC-CMs |
Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2) | Fisher Scientific | m33-500 | Tyrode’s solution |
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix | Corning | 356230 | Flexible Hydrogel Substrate |
Microcentrifuge tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | Hydrogel Substrate Aliquot |
Model 4100 Isolated High Power Stimulator | AM-Systems | Model 4100 | Pulse Generator |
MyCell Cardiomyocytes DCM LMNA L35P, 01016 | Fujifilm Cellular Dynamic, Inc. | R1153 | DCM hiPSC-CMs |
Pen-Strep | Invitrogen | 15140-122 | Cardiomyocyte Media |
Pipette L-20 | Rainin | 17014392 | Plating Hydrogel Substrate |
Pipette P1000 | Fisher Scientific | F123602G | |
Pipette tips, 1000 ul | Fisher Scientific | 02-707-509 | |
Pipette tips, 20 ul | Rainin | GPS-L10S | Making Hydrogel Substrate |
Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P330-500 | Tyrode’s solution |
RPMI 1640, with glucose | Invitrogen | 11875 | Cardiomyocyte Media |
Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | s641-212 | Tyrode’s solution |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 221465 | Tyrode’s solution |
Stimulation Electrodes | Pacing and CCM Stimulation | ||
Stopwatch/Timer | Fisher Scientific | 02-261-840 | Plating Hydrogel Substrate |
Trypan Blue Stain | Life Technologies | T10282 | hiPSC-CM Counting |
TrypLE Express | Life Technologies | 12605-010 | hiPSC-CM Dissociation |
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