Summary
Här demonstrerar vi en icke-invasiv metod för utvärdering av kontraktilitet för hjärtmedicinsk utrustning med användning av 2D-humaninducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter (hiPSC-CM) monolager, pläterade på ett flexibelt substrat, i kombination med videobaserad mikroskopi. Detta verktyg kommer att vara användbart för in vitro-utvärdering av kontraktila egenskaper hos hjärtelektrofysiologiska enheter.
Abstract
Humant inducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter (hiPSC-CMs) undersöks för närvarande för flera in vitro-applikationer och har använts i regulatoriska ansökningar. Här utvidgar vi deras användning till säkerhets- eller prestandabedömningar av hjärtmedicinsk utrustning. Vi utvecklade en ny metod för att utvärdera kontraktila egenskaper hos hjärtmedicinsk utrustning i robust kontraherande 2D hiPSC-CMs monolager pläterade på ett flexibelt extracellulärt matris (ECM) -baserat hydrogelsubstrat. Detta verktyg möjliggör kvantifiering av effekterna av hjärtelektrofysiologiska enhetssignaler på mänsklig hjärtfunktion (t.ex. kontraktila egenskaper) med standardlaboratorieutrustning. 2D hiPSC-CM-monolagren odlades i 2-4 dagar på ett flexibelt hydrogelsubstrat i ett 48-brunnsformat.
hiPSC-CMs utsattes för standard hjärtkontraktilitetsmodulering (CCM) elektriska signaler för medicinsk utrustning och jämfördes med kontroll (dvs. endast pacing) hiPSC-CM. Baslinjens kontraktila egenskaper hos 2D hiPSC-CMs kvantifierades genom videobaserad detektionsanalys baserad på pixelförskjutning. De CCM-stimulerade 2D hiPSC-CMs pläterade på det flexibla hydrogelsubstratet visade signifikant förbättrade kontraktila egenskaper i förhållande till baslinjen (dvs. före CCM-stimulering), inklusive en ökad toppkontraktionsamplitud och accelererad kontraktion och avslappningskinetik. Dessutom möjliggör användningen av det flexibla hydrogelsubstratet multiplexering av de videobaserade avläsningarna av hjärt-excitationskontraktionskoppling (dvs. elektrofysiologi, kalciumhantering och sammandragning) i friska och sjuka hiPSC-CM. Noggrann detektion och kvantifiering av effekterna av hjärtelektrofysiologiska signaler på mänsklig hjärtkontraktion är avgörande för utveckling, optimering och riskreducering av hjärtmedicinsk utrustning. Denna metod möjliggör robust visualisering och kvantifiering av hjärtsyncytiums kontraktila egenskaper, vilket bör vara värdefullt för icke-klinisk säkerhets- eller effektivitetstestning av hjärtmedicinsk utrustning. Detta dokument beskriver i detalj metoden för att generera 2D hiPSC-CM hydrogelsubstratmonolager.
Introduction
När USA: s befolkning åldras fortsätter antalet hjärtsviktpatienter att öka, tillsammans med de direkta medicinska kostnaderna 1,2. Det finns ett kritiskt behov av att utveckla nya terapier för att behandla hjärtsvikt och innovativa icke-kliniska metoder för att testa sådana terapier. Humant inducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter (hiPSC-CMs) har föreslagits som ett in vitro-verktyg för att underlätta den terapeutiska utvecklingsprocessen och har använts i regulatoriska inlämningar 3,4. Deras utbredda användning har dock begränsats för kontraktilitetsstudier på grund av bristen på robusta kontraktila egenskaper när de pläteras under standardstyva 2D-odlingsförhållanden (dvs. konventionell vävnadsodlingsplast eller glas)5,6,7,8. Vi har tidigare demonstrerat nyttan av att plätera isolerade enskilda hiPSC-CMs på ett flexibelt hydrogelsubstrat för att generera robusta synliga kontraktila egenskaper9. Vi visade att isolerade hiPSC-CMs har jämförbara kontraktila egenskaper med de hos nyligen isolerade vuxna kaninventrikulära kardiomyocyter. Dessutom demonstrerade vi användbarheten av denna metod för att bedöma kontraktila svar på farmakologiska medel7. Dessutom har andra studier tillämpat denna teknik på mekanistiska bedömningar för grundvetenskap och sjukdomsmodellering10,11,12. Här har denna metod utvidgats till 2D hiPSC-CM-monolager, och dess användbarhet vid utvärdering av fysiologiskt relevanta elektriska signaler för hjärtkontraktilitet modulering (CCM) in vitro demonstreras.
CCM är en intrakardiell hjärtsviktsbehandling där icke-excitatoriska elektrofysiologiska signaler levereras till myokardiet under den absoluta eldfasta perioden av hjärtcykeln13,14. Reproducerbara metoder för att utvärdera CCM i humana hjärtcellsmodeller saknas. Tidigare arbete har använt olika hjärtcellsmodeller för att utvärdera CCM-kontraktilsvaret. Vi visade in vitro att nyisolerade kaninventrikulära kardiomyocyter svarar på CCM-stimulering genom en övergående ökning av kalcium och kontraktionsamplitud15. En annan studie på isolerade ventrikulära kardiomyocyter hos hundar visade CCM-inducerad förbättring av den intracellulära kalciumtransienta amplituden16. Majoriteten av CCM-studierna har dock använt ex vivo och in vivo djurpreparat. Dessa studier är svåra att korrelera med varandra eftersom de tillämpar en mängd olika CCM-pulsparametrar och arter17. En studie i en isolerad kaninpapillärmodell avslöjade ökad CCM-inducerad kontraktilitet8,18, och en rad helhjärtstudier har visat CCM-inducerad förbättring av kontraktil funktion19,20,21. Dessa studier har gett viktiga mekanistiska insikter. Det saknas dock reproducerbara humana modeller för in vitro hjärt-EP-kontraktila studier inklusive CCM. För detta ändamål har vi utvecklat flera 2D- och 3D-hiPSC-modeller och demonstrerat CCM-inducerad förbättring av kontraktila egenskaper på ett parameterberoende sätt. Dessutom har de CCM-inducerade inotropa effekterna visat sig delvis medieras av neuronal inmatning och β-adrenerg signalering 8,17,22. Ändå behöver mer vara känt om mekanismerna för CCM-terapi, och användning av kontraherande humana kardiomyocyter kan hjälpa till att uppnå detta resultat. Som sådan finns det ett betydande behov av att utveckla mänskliga icke-kliniska verktyg för att utvärdera nya CCM-enheter och signaler, påskynda regleringsprocessen, minska belastningen på djurmodeller och hjälpa enhetsutvecklare att fatta beslut 8,17,23,24. Det är viktigt att utveckla enkla, gör-det-själv-protokoll som kan överföras till vilket laboratorium som helst och som använder standardutrustning och låga cellkrav för att minska kostnaderna. Denna metod belyser effekterna av CCM-stimulering på human kardiomyocytfunktion och ger viktiga insikter om CCM-säkerhet eller effektivitet17. Här beskriver vi metoden för att generera 2D hiPSC-CM-monolager på ett flexibelt hydrogelsubstrat för att producera ett standardiserat icke-kliniskt verktyg för att kvantifiera akut hjärtelektrofysiologisk medicinsk utrustning (dvs. CCM) kontraktila svar i hälsa och sjukdom.
Protocol
1. Beredning av plattor och media
OBS: En typisk extracellulär matris (ECM)-baserad hydrogelalikvot är ~ 200 μL i ett sterilt 1,5 ml rör lagrat vid −20 ° C.
- I en steril vävnadsodlingshuva, förbered en steril 6-brunnsplatta genom att överföra 2 ml 0,1% gelatin (materialtabell) till varje brunn. Placera locket på plattan med 6 brunnar och låt den belagda plattan inkubera vid 37 °C i minst 1 timme.
- En dag innan du sådd hiPSC-CMs på det flexibla hydrogelsubstratet, tina en hydrogel (Table of Materials) alikvot i kylskåpet på is.
- Förbered kardiomyocytmediet (materialtabell) genom att blanda 500 ml RPMI 1640, 10 ml 50x B-27-tillskott och 5 ml penicillin-streptomycin9.
2. Sådd av kryokonserverade hiPSC-CM
- Två dagar före sådd av hiPSC-CMs på det flexibla hydrogelsubstratet, förplatta hiPSC-CMs på 0,1% gelatinbelagda sterila 6-brunnsplattor. Tina hiPSC-CM med ett standardupptiningsprotokoll 9,25.
- Platta sedan 1 500 000 hiPSC-CM totalt (materialförteckning) per brunn enligt tillverkarens instruktioner (figur 1A)26.
- Odla hiPSC-CMs i standard kardiomyocytmedium i 2-4 dagar så att hiPSC-CMs kan återhämta sig från kryokonservering vid 37 ° C och 5% CO2. Uppdatera det förbrukade mediet med 100% kardiomyocytmedium var 48: e timme.
3. Dissociation och räkning av de förpläterade hiPSC-CM
- Kontrollera status för hiPSC-CM före dissociation. Utvärdera hälsan hos hiPSC-CM, vilket säkerställer livskraft och stabil slagning.
Renheten hos hiPSC-CM-populationen är viktig (t.ex. >90% hjärttroponin T)7. En kardiomyocytvalsmetod (t.ex. metabolisk selektion eller sortering) rekommenderas för att minska störningen av hydrogelsubstratet av icke-kardiomyocytceller25,26. - Tvätta hiPSC-CMs 2x med 4 ml per brunn D-PBS utan CaCl 2 eller MgCl2 (materialtabell). Aspirera D-PBS, tillsätt 1 ml dissociationsreagens vid rumstemperatur till varje brunn och inkubera sedan i 15 minuter vid 37 °C.
- Tillsätt 10 ml kardiomyocytmedium till ett sterilt 15 ml koniskt rör.
- Separera hiPSC-CM från 6-brunnsplattan med en 1 000 μL pipett (figur 1B). Tillsätt cellsuspensionen till det 15 ml koniska röret26.
- Skölj brunnen med 1 ml färskt kardiomyocytmedium för att samla upp eventuella kvarvarande hiPSC-CM och tillsätt dem till det 15 ml koniska röret. Ta den slutliga volymen av det koniska röret till 15 ml.
- Centrifugera i 5 min (200 × g). Ta bort supernatanten upp till 1 ml-märket. Resuspendera cellerna i kardiomyocytmedium till en slutlig volym på 5 ml.
- Räkna hiPSC-CM med en manuell eller automatiserad cellräknare.
- Inkubera hiPSC-CM-suspensionen vid rumstemperatur medan de flexibla hydrogelsubstraten bereds (högst 30 min).
4. Beredning av de flexibla hydrogelsubstraten
- Bered en 20 μL pipettuppsättning vid 1 μL, 20 μL pipettspetsar (t.ex. 20 μL) och en steril bottenplatta av glas med 48 brunnar. Se till att ett stoppur / timer är klart innan hydrogelsubstraten tillverkas.
- Blanda det ECM-baserade hydrogelsubstratet i den sterila vävnadsodlingshuven genom att försiktigt knacka på röret och placera det omedelbart tillbaka på is.
- Starta sedan stoppuret / timern omedelbart innan det första hydrogelsubstratet pläteras - det här är tid noll.
- Pipettera 1 μL av hydrogelsubstratet upp och ner ~3x för att kyla pipettspetsen. Applicera ~1 μL av det outspädda hydrogelsubstratet horisontellt på botten av varje brunn på 48-brunnsplattan (figur 1C, figur 2A och figur 3A) och håll pipetten i 45° vinkel. Platta alla hydrogelsubstrat i samma orientering i varje brunn (figur 2 och figur 3) för att identifiera substratet när experimenten utförs vid 40x förstoring 7,9,17,27.
OBS: Varje ~ 1 μL linje är ett hydrogelsubstrat (figur 3). Vanligtvis tar det ~ 5 minuter att förbereda 48 brunnar. Användningen av ett horisontellt lutande mikroplattstativ (t.ex. 30 °) kan möjliggöra en bättre bild av brunnens botten och hydrogelsubstratet. Var noga med att gå hela längden på brunnen (dvs från vänster till höger). Korta hydrogelsubstrat kan vara för tjocka, vilket minskar substratstabiliteten. Låt inte hydrogelsubstratet torka i pipettspetsen. Om detta inträffar, byt snabbt till ett nytt tips och fortsätt omedelbart. Alternativt kan kylda pipettspetsar användas. Det ECM-baserade hydrogelsubstratet kan snabbt polymerisera när det inte ligger på is. Beredning av flera brunnar åt gången (t.ex. 10) föreslås. Dessutom rekommenderas att öva i en mock 48-brunnsplatta. - Placera locket på plattan med 48 brunnar och låt hydrogelsubstraten inkubera i 8-10 minuter vid rumstemperatur i den sterila vävnadsodlingshuven innan cellerna tillsätts (figur 2B).
OBS: Det är viktigt att följa de föreslagna inkubationstiderna. En inkubationstid på mer än 10 min leder till styva hydrogelsubstrat och inga synliga sammandragningar. En inkubationstid på mindre än 8 min kan leda till substrat som kollapsar. - Frö omedelbart hiPSC-CMs droppvis direkt på hydrogelsubstraten, med ~ 30 000 livskraftiga hiPSC-CMs per brunn i en låg medelvolym på ~ 200 μL kardiomyocytmedium, med en 1,000 μL pipett (figur 2B och figur 3B).
OBS: Denna process stoppar hydrogelsubstratpolymerisationen och säkerställer att hiPSC-CM finns på substratet 7,9,17,27. - Placera locket på plattan och låt hiPSC-CMs inkubera ostört i 10-15 minuter vid rumstemperatur (figur 2C) i den sterila vävnadsodlingshuven så att hiPSC-CM kan fästa vid hydrogelsubstratet.
- Tillsätt försiktigt ~ 100 μL färskt kardiomyocytmedium till varje brunn (slutlig volym: ~ 300 μL per brunn). Lägg locket på plattan och överför till en inkubator vid 37 °C, 5%CO2 i 2-4 dagar. Uppdatera 100% mediet var 24: e timme innan sammandragningsexperimenten utförs.
OBS: Inspektera hiPSC-CM visuellt för korrekt morfologi; omedelbart efter pläteringen ska hiPSC-CM vara runda (figur 3B). Vid dag 2 efter sådd observeras ett konfluent 2D hiPSC-CM monolagersyncytium (figur 3C) (kompletterande video S1) med robust synlig sammandragning (kompletterande video S2).
5. Kontraktionsregistrering och analys
- Bered CCM-analysmediet, som är Tyrodes lösning innehållande följande (i mmol / L): CaCl 2 0,5, NaCl 134, KCl 5,4, MgCl2 1, glukos 10 och HEPES 10, med pH justerat till 7,4 med NaOH och jämvikt till 37 ° C i ett vattenbad.
OBS: Submaximalt extracellulärt kalcium (0,5 mM) används för att förbättra CCM-analysfönstret. - Slå på mikroskopet och miljökontrollkammaren för att balansera till 37 ° C och 5% CO2.
- Ta bort kardiomyocytmediet från 48-brunnsplattan och skölj försiktigt varje brunn två gånger med 600 μL CCM-analysmedium.
- Tillsätt 300 μL CCM-analysmedium per brunn och placera 48-brunnsplattan på mikroskopet i miljökontrollkammaren. Sätt in elektroderna och balansera cellerna i 5 minuter.
- Använd videobaserad mikroskopi för att spela in kontraktionsvideor. Öppna videoinspelningsprogrammet och ställ in en bildhastighet på 100 bilder / s. Välj en region av intresse (ROI) nära mitten av hiPSC-CM-monolagret.
Välj inte en ROI nära kanten av hiPSC-CM-monolagren eftersom detta kan vara instabilt för kontraktila inspelningar. - Därefter stimulerar fältet cellerna med en kommersiell pulsgenerator (Table of Materials) för att elektriskt takta 2D hiPSC-CM-monolagren. Takta hiPSC-CMs vid 1,5x tröskel vid 1 Hz med baslinjepulsparametrar (t.ex. monofasiska fyrkantvågspulser med en 2 ms stimulanspulsvaraktighet på ~ 14 V / cm)17.
- Spela in baslinjen, endast tempo (dvs. före CCM) (figur 1D) sammandragningsvideo i minst fem slag17,28.
- Stimulera sedan hiPSC-CM-monolagret med en experimentell elektrisk signal (figur 1D). För att följa detta protokoll, använd standard CCM-stimuleringsparametrar: två symmetriska bifasiska pulser med 5,14 ms fasvaraktighet (20,56 ms total varaktighet), ~ 28 V / cm (fasamplitud), noll interfasintervall och en 30 ms fördröjning (dvs. tid från slutet av pacingpulsen till början av CCM-pulsen) (figur 1D)29,30 och spela in den CCM-inducerade kontraktionsvideon i minst fem taktslag.
- Stäng av CCM-signalen, stimulera med en baslinjepuls och spela in en sammandragningsvideo av återhämtningsperioden (dvs. efter CCM) i minst fem slag.
- Använd standardkontraktionsprogramvara för att automatiskt analysera kontraktionsvideorna och kvantifiera de viktigaste kontraktila egenskaperna (t.ex. kontraktionsamplitud, kontraktionslutning, avkopplingslutning, tid till topp, tid till baslinje 90% och kontraktionstid 50%)7,17,31,32.
- Använd 2D hiPSC-CMs på det flexibla hydrogelsubstratet för kontraktila experiment från dag 2-14 efter plätering på substratet.
Representative Results
I detta protokoll beskrivs ett enkelt, robust verktyg för att generera synligt kontraherande 2D hiPSC-CM-monolager på ett flexibelt hydrogelsubstrat. Mätningen av kontraktila egenskaper utförs med videobaserad inspelning i kombination med kontraktilitetsanalysprogramvara. Detta möjliggör kvantifiering av nyckelparametrar för kardiomyocytkontraktilitet, inklusive kontraktionsamplitud, kontraktionslutning, avkopplingslutning, tid till topp, tid till baslinje 90% och kontraktionstid 50%. Modellen används för att karakterisera baslinjens kontraktila egenskaper hos hiPSC-CMs (figur 4) från olika "friska" donatorer och kan utvidgas till utvärdering av hjärtelektrofysiologiska medicintekniska signaler (dvs. CCM). Tillämpningen av standardstimuleringsparametrarna för CCM (figur 1D)29,30 resulterade i förbättrade kontraktila egenskaper in vitro (figur 5 och tabell 1)17.
Vi visade vidare att denna metod kan användas för att utvärdera effekterna av modulering av extracellulära kalciumkoncentrationer på humana kontraktila egenskaper med och utan CCM-stimulering (Figur 6)17. Det förväntade kalciumberoendet av kontraktion vid baslinjen observerades 7,17, liksom en CCM-inducerad ökning av kalciumkänsligheten vid nivån av kardiomyocytmonolagret. Dessutom avslöjade den farmakologiska undersökningen av den β-adrenerga signalvägen (figur 7) att de CCM-inducerade inotropa effekterna delvis medierades av β-adrenerg signalering17. Dessutom kan detta verktyg utvidgas till patientspecifika sjukdomskardiomyocyter, inklusive dilaterad kardiomyopati (DCM)33,34,35 (figur 8), för att förstå effekten av CCM i samband med sjukdomstillstånd; Faktum är att förbättrad kontraktil amplitud och accelererad kontraktions- och avslappningskinetik observerades vid CCM-"dosen" som testades här (figur 8). Medan vi har en CCM-efterliknande enhet i vårt laboratorium, är metoden som används här inte specifik för det systemet och kan tillämpas på andra hjärtelektrofysiologiska enheter.
Figur 1: Schematisk sammanfattning av 2D hiPSC-CM in vitro CCM-modellen. (A) hiPSC-CMs är förpläterade i monolagerformat på gelatin (0,1%)-belagda 6-brunnsplattor. (B) Efter 2 dagar i odling dissocieras hiPSC-CM och förbereds för plätering på ett flexibelt hydrogelsubstrat. (C) De isolerade hiPSC-CMs pläteras med hög densitet på hydrogelsubstrat arrangerade i ett 48-brunnsformat (vänster) och analyseras i (0,5 mM) extracellulärt kalcium Tyrodes lösning (höger). (D) En kommersiell pulsgenerator och standard kliniska CCM-pulsparametrar29,30 (höger) används för att stimulera hiPSC-CM. Hjärtfunktionen bedöms genom videobaserad analys (vänster). E) Representativa kontraktionsregistreringar före CCM (baslinje: 5 V), under CCM (CCM: 10 V) och efter CCM (utbyte: 5 V). Denna siffra har återtryckts från Feaster et al.17. Förkortningar: hiPSC-CM = humant inducerad pluripotent stamcellshärledd kardiomyocyt; CCM = hjärtkontraktilitetsmodulering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Schematisk bild av plätering och sådd av det flexibla hydrogelsubstratet. (A) Fullständigt tinat, outspätt ECM-baserat hydrogelsubstrat appliceras på en steril 48-brunnsplatta (vänster panel), med 1 μL hydrogelsubstrat per brunn (höger panel). (B) Hydrogelsubstratet får inkuberas vid rumstemperatur i 8-10 minuter (höger panel), följt av plätering av hiPSC-CM med hög densitet i en låg medelvolym (~ 200 μL) (vänster panel). (C) Efter 10-15 minuters inkubation tillsätts medium till varje brunn (vänster panel) och plattorna flyttas till en standardinkubator för vävnadsodling (höger panel). Förkortningar: ECM = extracellulär matris, hiPSC-CM = humant inducerad pluripotent stamcellshärledd kardiomyocyt; RT = rumstemperatur. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Extracellulärt matrisbaserat hydrogelsubstrat. (A) Representativt hydrogelsubstrat (inga celler) i en brunn i en bottenplatta av glas med 48 brunnar omedelbart efter det att substratet applicerats på brunnen. (B) Tid 0 efter att hiPSC-CM har seedats. (C) Tid 24 timmar efter det att hiPSC-CM har sådd. Denna panel trycktes om från Feaster et al.17. De vita pilarna indikerar kanten på hydrogelsubstratet, 4x förstoring. Skalstång = 1 mm. Förkortning: hiPSC-CM = humant inducerad pluripotent stamcellshärledd kardiomyocyt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Karakterisering av 2D hiPSC-CM monolayer kontraktila egenskaper. (A) Representativ kontraktionsregistrering av 2D hiPSC-CMs tempo vid 1 Hz (5 V). (B) Representativa kontraktionsspår som visar en kontraktionscykel. (C) Sammanfattande stapeldiagram. Data är medelvärde ± SEM. n = 18. Förkortning: hiPSC-CM = humant inducerad pluripotent stamcellshärledd kardiomyocyt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Akut effekt av CCM på 2D hiPSC-CM kontraktila egenskaper. (A) Representativ kontraktionsregistrering för före CCM (5 V), under CCM (10 V) och efter CCM (5 V). (B) Representativa kontraktionsspår av de omedelbara effekterna (dvs. sista före-CCM-slag, första CCM-slag och första efter-CCM-slag, indikerat med +). (C) Sammanfattande stapeldiagram över de omedelbara effekterna. Procentuell förändring, data är medelvärde ± SEM. n = 23. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Denna siffra har återtryckts från Feaster et al.17. Förkortningar: hiPSC-CM = humant inducerad pluripotent stamcellshärledd kardiomyocyt; CCM = hjärtkontraktilitetsmodulering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Effekt av extracellulär kalciummodulering på CCM-svaret. a) Representativa kontraktionsspår av de omedelbara effekterna för varje grupp före kaustik kalcinerad magnesiumoxid (5 V), under kaustik magnesiumoxid (10 V) och efter kastik magnesiumoxid (5 V). hiPSC-CMs utsattes för ökande koncentrationer av extracellulärt kalcium (Cao) på 0,25-2 mM. (B-D) Transformerade data (sigmoidal) för att vägleda ögat som visar effekten av CCM på kalciumkänsligheten hos kontraktila egenskaper (dvs. amplituden och kinetiken) (sluttning = 1,0). n = 6-8 per grupp. Denna siffra har återtryckts från Feaster et al.17. Förkortningar: hiPSC-CM = humant inducerad pluripotent stamcellshärledd kardiomyocyt; CCM = hjärtkontraktilitetsmodulering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Farmakologisk utmaning. Representativa kontraktionsspår för varje grupp före CCM (5 V), under CCM (10 V) och efter CCM (5V); hiPSC-CM förbehandlades med (A) vehikel eller (B) metoprolol (2 μM). (C,D) Sammanfattande stapeldiagram för varje villkor. Procentuell förändring, data är medelvärde ± SEM. n = 10 per grupp. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Denna siffra har återtryckts från Feaster et al.17. Förkortningar: hiPSC-CM = humant inducerad pluripotent stamcellshärledd kardiomyocyt; CCM = hjärtkontraktilitetsmodulering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Akut effekt av CCM på kontraktila egenskaper hos sjuka 2D hiPSC-CMs. (A) Representativt kontraktionsspår för DCM L35P, kontrollbaslinje (före, 6 V) och DCM L35P plus CCM (10 V). (B) Sammanfattande stapeldiagram. Procentuell förändring, data är medelvärde ± SEM. n = 3. *p < 0,05, **p < 0,01. Förkortningar: hiPSC-CM = humant inducerad pluripotent stamcellshärledd kardiomyocyt; CCM = hjärtkontraktilitetsmodulering; DCM = dilaterad kardiomyopati. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande video S1: Timelapse av hiPSC-CMs på den extracellulära matrisbaserade hydrogelen. Tvådimensionella hiPSC-CMs pläterade på det flexibla hydrogelsubstratet; Tid: 0-90 h; en brunn av en 48-brunns glasbottenplatta; 4x förstoring. HiPSC-CM bildar ett horisontellt monolagersynkytium (dvs vänster till höger). Skalstång = 1 mm. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Kompletterande video S2: hiPSC-CMs på den extracellulära matrisbaserade hydrogelen. Tvådimensionella hiPSC-CMs pläterade på det flexibla hydrogelsubstratet; Tid: ~ 24 h; en brunn av en 48-brunns glasbottenplatta; 4x förstoring. HiPSC-CMs bildar monolagermorfologi och visar robust sammandragning vid ~ 24 h efter plätering. Skalstång = 1 mm. Denna video är från Feaster et al.17. Klicka här för att ladda ner den här videon.
| Parameter | CCM | Efter |
| Amplitud | 16 ± 4%** | 4 ± 5% |
| Tid till topp 50% | -20 ± 9%* | 7 ± 5% |
| Tid till topp 90% | -22 ± 8%* | 6 ± 5% |
| Tid till baslinje 50 % | -8 ± 5% | 4 ± 4% |
| Tid till baslinjen 90 % | -12 ± 6%* | 5 ± 5% |
| Kontraktionstid 10% | -13 ± 6% | 3 ± 5% |
| Kontraktionstid 50% | -6 ± 5 % | 3 ± 5% |
| Kontraktionstid 90% | 0 ± 5% | 3 ± 4% |
| N | 23 | 23 |
Tabell 1: Kontraktila egenskaper. Procentuell förändring jämfört med före CCM (5 V); data är medelvärde ± SEM för alla slag i varje grupp under CCM (10 V) och efter CCM (5 V). n = 23. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Denna tabell har återgivits från Feaster et al.17.
Discussion
Protokollet som beskrivs här beskriver en metod för att generera robust kontraherande 2D hiPSC-CM-monolager på ett flexibelt extracellulärt matris (ECM)-baserat hydrogelsubstrat med kommersiella reagens 7,17. HiPSC-CMs sådda på det flexibla hydrogelsubstratet förblir livskraftiga och har förbättrade kontraktila egenskaper7. Denna teknik bygger på standardlaboratorieutrustning och kapacitet7. Det finns flera kritiska steg i protokollet, inklusive i förhållande till arbetet med det ECM-baserade hydrogelsubstratet, som kräver noggrann uppmärksamhet på detaljer. Ett potentiellt problem är närvaron av serum i mediet. Detta kan leda till att hiPSC-CM bildar nätverk (t.ex. endoteliala/vaskulära nätverk) istället för ett konfluent monolagerark; därför rekommenderas ett serumfritt medium vid upprättandet av de flexibla hydrogelmonolagren hiPSC-CM (dvs. dag 0 till dag 4). På samma sätt kan beredning av för många hydrogelsubstrat samtidigt resultera i dåliga eller ojämna substrat på grund av operatörströtthet. Även om det är viktigt att arbeta snabbt är integriteten hos varje hydrogelsubstrat kritisk. På samma sätt bör man noggrant fröa hiPSC-CM och byta medium; Detta bör inte göras kraftfullt. Vid byte av medium bör det tillsättas försiktigt från brunnens övre kant för att inte störa hydrogelsubstratet eller cellerna. Som med standard 2D hiPSC-CM-kulturer (dvs. konventionell vävnadsodlingsplast eller glas) kommer plätering med låg densitet att resultera i ofullständig enskiktsbildning. Det är viktigt att visuellt inspektera hiPSC-CM för att bekräfta att de finns på hydrogelsubstratet och att använda en timer för att säkerställa korrekt timing. Dessutom kan odling av 2D hiPSC-CM-monolager i mer än 14 dagar på hydrogelsubstratet resultera i enskiktsstörningar, baserat på ECM-egenskaperna och instruktionerna från tillverkaren av substratet.
Det finns flera begränsningar för den nuvarande metoden som måste beaktas. För det första var cellerna som användes i detta protokoll från en kommersiell hiPSC-CMs-leverantör, och dessa celler bildar ett syncytium av elektriskt kopplade celler. Synkytiet innehåller en blandning av hiPSC-CM från alla tre hjärtsubtyperna (dvs. ventrikulär, förmak och nodal)17. Studier kan dra nytta av en subtyp-exklusiv hiPSC-CM-population (dvs. 100% ventrikulär eller 100% förmak). För det andra använde denna metod endast hiPSC-CM, medan icke-myocyter, inklusive hjärtfibroblaster, endotelceller och neuroner, kan förbättra hiPSC-CM-funktionaliteten22,36. För det tredje visar 2D hiPSC-CMs flera egenskaper hos relativt omogna kardiomyocyter, inklusive spontan slagning, amorf morfologi och brist på inotropt svar 8,37. För det fjärde, medan detta protokoll producerar robust kontraherande 2D hiPSC-CM-monolager, är det troligt att funktionellt förbättrade 3D hiPSC-CM-modeller såsom konstruerade hjärtvävnader (ECT) kommer att resultera i ett förbättrat CCM-inducerat kontraktilt svar under fysiologiska kalciumkoncentrationer 8,38. Slutligen är protokollet som beskrivs här utformat för ett 48-brunnsformat. Men med optimering och inkludering av automatisering kan detta skalas till ett format med hög genomströmning (t.ex. plattor med 96 brunnar eller 384 brunnar).
Den nuvarande guldstandarden för hiPSC-CM-studier är konventionella styva 2D-odlingsförhållanden (dvs. vävnadsodlingsplast eller glas). Även om den konventionella metoden är användbar för elektrofysiologi3 och kalciumhantering39 studier, resulterar den i minimala kontraktila egenskaper 5,6,7. Som ett resultat är konventionella styva 2D-odlingsförhållanden inte mottagliga för bedömning av CCM-kontraktila effekter8. Funktionellt förbättrade 3D hiPSC-CM ECT-metoder38 är tekniskt utmanande, tidskrävande och kräver sofistikerad utrustning som inte är lätt tillgänglig i alla laboratorier. I detta protokoll beskriver vi en enkel metod för att generera robust kontrakterande 2D hiPSC-CM-monolager inom en kortare tidsram än 3D ECT-metoder eller långsiktiga, konventionella 2D-metoder 7,40,41. Dessutom är de reagens som används här kommersiellt tillgängliga, inklusive hydrogelsubstratet och hiPSC-CM, och båda har betydande parti-till-parti-konsistens. Medan vi använde avtagbara platinatrådelektroder (interelektrodavstånd: 2,0 mm, bredd: 1,0 mm), är olika elektrodmaterial och konfigurationer mottagliga för CCM-kontraktila bedömningar in vitro 8,15,17,18,22. På samma sätt finns det flera automatiserade program tillgängliga som möjliggör analys av sammandragningsvideor 7,31,32.
Majoriteten av icke-kliniska metoder för att utvärdera kontraktilitet för hjärtmedicinsk utrustning bygger till stor del på kostsamma in vivo-djurmodeller (t.ex. hundar eller grisar) och tekniskt utmanande papillära muskelremsor (t.ex. kaniner)18. Denna artikel beskrev en human in vitro-modell för att utvärdera effekterna av hjärtelektrofysiologiska medicintekniska signaler på kontraktilitet. Detta verktyg skulle kunna minska beroendet av djurstudier och vara användbart för in vitro-utvärdering av kontraktila egenskaper hos hjärtelektrofysiologiska enheter.
Disclosures
Denna artikel återspeglar författarnas åsikter och bör inte tolkas för att representera US Food and Drug Administration åsikter eller politik. Omnämnandet av kommersiella produkter, deras källor eller deras användning i samband med det material som rapporteras här ska inte tolkas som varken ett faktiskt eller underförstått godkännande av sådana produkter av Department of Health and Human Services. Författarna förklarar inga konkurrerande intressen för detta arbete.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av ett möte till forskningsdeltagandeprogrammet vid Center for Devices and Radiological Health som administreras av Oak Ridge Institute for Science and Education genom ett interagenturavtal mellan US Department of Energy och US Food and Drug Administration. Författarna tackar Richard Gray, Trent Robertson och Anna Avila för deras förslag och tekniska hjälp. Studien finansierades genom US Food and Drug Administration, Office of Science and Engineering Laboratories.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Gelatin | STEMCELL Technologies | 7903 | Pre-plating Culture Substrate |
| 48-well Plate | MatTek | P48G-1.5-6-F | Hydrogel Substrate hiPSC-CM Culture, Glass |
| 6-well Plate | Thermofisher | 140675 | hiPSC-CM Culture, Plastic |
| B-27 Supplement, with insulin | Invitrogen | 17504-044 | Cardiomyocyte Media |
| Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) | Fisher Scientific | c70-500 | Tyrode’s solution |
| CellOPTIQ Platform and Software | Clyde Biosciences | Contraction Recording and Analysis | |
| Conical tube 15 mL | Corning | 352099 | hiPSC-CM Dissociation |
| Digital CMOS Camera | Hamamatsu | C11440-42U30 | Contraction Video Recording |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | Cell Wash |
| Environmental Control Chamber | OKOLAB INC | H201-K-FRAME | Environmental Regulation |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1kg | Tyrode’s solution |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 22-600-107 | hiPSC-CM Counting |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s solution |
| iCell Cardiomyocytes Plating Medium | Fujifilm Cellular Dynamic, Inc. | M1001 | hiPSC-CM Plating Media |
| iCell Cardiomyocytes2, 01434 | Fujifilm Cellular Dynamic, Inc. | R1017 | hiPSC-CMs |
| Incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermofisher | 50116047 | Maintain hiPSC-CMs |
| Inverted Microscope | Olympus | IX73 | Imaging hiPSC-CMs |
| Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2) | Fisher Scientific | m33-500 | Tyrode’s solution |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix | Corning | 356230 | Flexible Hydrogel Substrate |
| Microcentrifuge tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | Hydrogel Substrate Aliquot |
| Model 4100 Isolated High Power Stimulator | AM-Systems | Model 4100 | Pulse Generator |
| MyCell Cardiomyocytes DCM LMNA L35P, 01016 | Fujifilm Cellular Dynamic, Inc. | R1153 | DCM hiPSC-CMs |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140-122 | Cardiomyocyte Media |
| Pipette L-20 | Rainin | 17014392 | Plating Hydrogel Substrate |
| Pipette P1000 | Fisher Scientific | F123602G | |
| Pipette tips, 1000 ul | Fisher Scientific | 02-707-509 | |
| Pipette tips, 20 ul | Rainin | GPS-L10S | Making Hydrogel Substrate |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P330-500 | Tyrode’s solution |
| RPMI 1640, with glucose | Invitrogen | 11875 | Cardiomyocyte Media |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | s641-212 | Tyrode’s solution |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 221465 | Tyrode’s solution |
| Stimulation Electrodes | Pacing and CCM Stimulation | ||
| Stopwatch/Timer | Fisher Scientific | 02-261-840 | Plating Hydrogel Substrate |
| Trypan Blue Stain | Life Technologies | T10282 | hiPSC-CM Counting |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12605-010 | hiPSC-CM Dissociation |
References
- Jackson, S. L., et al. National burden of heart failure events in the United States, 2006 to 2014. Circulation: Heart Failure. 11 (12), 004873 (2018).
- Cook, C., Cole, G., Asaria, P., Jabbour, R., Francis, D. P. The annual global economic burden of heart failure. International Journal of Cardiology. 171 (3), 368-376 (2014).
- Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
- Yang, X., Ribeiro, A. J. S., Pang, L., Strauss, D. G. Use of human iPSC-CMs in nonclinical regulatory studies for cardiac safety assessment. Toxicology Sciences. 190 (2), 117-126 (2022).
- Zuppinger, C. 3D cardiac cell culture: A critical review of current technologies and applications. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87 (2019).
- Huethorst, E., et al. Conventional rigid 2D substrates cause complex contractile signals in monolayers of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 600 (3), 483-507 (2022).
- Feaster, T. K., et al. Matrigel mattress: A method for the generation of single contracting human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 117 (12), 995-1000 (2015).
- Feaster, T. K., et al. Acute effects of cardiac contractility modulation stimulation in conventional 2D and 3D human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte models. Frontiers in Physiology. 13, 1023563 (2022).
- Feaster, T. K. Implementation of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte to model excitation-contraction coupling in health and disease. , Vanderbilt University Medical Center. PhD thesis (2015).
- Cadar, A. G., et al. Real-time visualization of titin dynamics reveals extensive reversible photobleaching in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 318 (1), 163-173 (2020).
- Parikh, S. S., et al. Thyroid and glucocorticoid hormones promote functional T-tubule development in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 121 (12), 1323-1330 (2017).
- Wang, L., et al. Hypertrophic cardiomyopathy-linked mutation in troponin T causes myofibrillar disarray and pro-arrhythmic action potential changes in human iPSC cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 320-327 (2018).
- Campbell, C. M., Kahwash, R., Abraham, W. T. Optimizer Smart in the treatment of moderate-to-severe chronic heart failure. Future Cardiology. 16 (1), 13-25 (2020).
- PMA P180036. FDA Summary of Safety and Effectiveness Data. Food and Drug Administration. , Available from: https://www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf18/P180036B.pdf (2019).
- Blinova, K., et al. Acute effects of nonexcitatory electrical stimulation during systole in isolated cardiac myocytes and perfused heart. Physiological Reports. 2 (8), 12106 (2014).
- Sabbah, H. N., et al. Cardiac contractility modulation with the impulse dynamics signal: Studies in dogs with chronic heart failure. Heart Failure Reviews. 6 (1), 45-53 (2001).
- Feaster, T. K., Casciola, M., Narkar, A., Blinova, K. Acute effects of cardiac contractility modulation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Physiological Reports. 9 (21), 15085 (2021).
- Brunckhorst, C. B., Shemer, I., Mika, Y., Ben-Haim, S. A., Burkhoff, D. Cardiac contractility modulation by non-excitatory currents: Studies in isolated cardiac muscle. European Journal of Heart Failure. 8 (1), 7-15 (2006).
- Mohri, S., et al. Cardiac contractility modulation by electric currents applied during the refractory period. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 282 (5), 1642-1647 (2002).
- Mohri, S., et al. Electric currents applied during refractory period enhance contractility and systolic calcium in the ferret heart. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (4), 1119-1123 (2003).
- Burkhoff, D., et al. Electric currents applied during the refractory period can modulate cardiac contractility in vitro and in vivo. Heart Failure Reviews. 6 (1), 27-34 (2001).
- Narkar, A., Feaster, T. K., Casciola, M., Blinova, K. Human in vitro neurocardiac coculture (ivNCC) assay development for evaluating cardiac contractility modulation. Physiological Reports. 10 (21), 15498 (2022).
- Harris, K., et al. Comparison of electrophysiological data from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to functional preclinical safety assays. Toxicological Sciences. 134 (2), 412-426 (2013).
- Blinova, K., et al. Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias. Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).
- Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
- Burridge, P. W., Holmstrom, A., Wu, J. C. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 87, 1-15 (2015).
- Cadar, A. G., Feaster, T. K., Durbin, M. D., Hong, C. C. Production of single contracting human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: Matrigel mattress technique. Current Protocols in Stem Cell Biology. 42, 1-7 (2017).
- Narkar, A., Willard, J. M., Blinova, K. Chronic cardiotoxicity assays using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs). International Journal of Molecular Sciences. 23 (6), 3199 (2022).
- OPTIMIZER® Smart Implantable Pulse Generator INSTRUCTIONS FOR USE. ImpulseDynamics. , Available from: https://impulse-dynamics.com/wp-content/uploads/2020/05/13-290-008-01-US-Rev-01-OPT-Smart-IPG-IFU.pdf (2018).
- OPTIMIZER™ Smart Mini Implantable Pulse Generator INSTRUCTIONS FOR USE. ImpulseDynamics. , Available from: https://impulse-dynamics.com/wp-content/uploads/2021/02/13-290-011-EU-Rev-00-OPTIMIZER-Smart-Mini-IPG-IFU-EU.pdf (2019).
- Sala, L., et al. MUSCLEMOTION: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).
- Grune, T., Ott, C., Haseli, S., Hohn, A., Jung, T. The "MYOCYTER" - Convert cellular and cardiac contractions into numbers with ImageJ. Scientific Reports. 9, 15112 (2019).
- Masarone, D., et al. Use of cardiac contractility modulation as bridge to transplant in an obese patient with advanced heart failure: A case report. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 9, 833143 (2022).
- Nadeem, M., Tariq, E. F., Aslam, H. M., Illahi, Y., Shah, R. All-cause mortality outcomes of usage of cardiac contractility modulation in patients with dilated cardiomyopathy ineligible for cardiac re-synchronization therapy: An updated meta-analysis of randomized controlled trials. Cureus. 12 (9), 10627 (2020).
- Manganelli, G., et al. Use of cardiac contractility modulation in an older patient with non-ischemic dilated cardiomyopathy: A case report. Clinics and Practice. 11 (4), 835-840 (2021).
- Mannhardt, I., et al. Automated contraction analysis of human engineered heart tissue for cardiac drug safety screening. Journal of Visualized Experiments. (122), e55461 (2017).
- Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
- Feric, N. T., et al. Engineered cardiac tissues generated in the Biowire™ II: A platform for human-based drug discovery. Toxicology Sciences. 172 (1), 89-97 (2019).
- Hwang, H. S., et al. Human induced pluripotent stem cell (hiPSC) derived cardiomyocytes to understand and test cardiac calcium handling: A glass half full. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 89, 379-380 (2015).
- Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).
- Stoehr, A., et al. Automated analysis of contractile force and Ca2+ transients in engineered heart tissue. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (9), 1353-1363 (2014).
