이 프로토콜은 베이지색 지방 생물학을 조사하기 위한 아데노 관련 바이러스(AAV)에 대한 대체 전략으로 지방 세포(AdipoSPH)에서 CRISPR SunTag-p65-HSF1(SPH)의 사용을 제시합니다. 내인성 Prdm16 유전자를 표적으로 하는 AAV 운반 sgRNA의 생체 내 주입은 베이지색 지방 발달을 유도하고 열 발생 유전자 프로그램을 향상시키기에 충분합니다.
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방법 논문
CRISPR SunTag-p65-HSF1 활성화 시스템을 이용한 베이지색 지방 생물학 및 대사 조사
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 기술은 생물학에 혁명을 일으켰으며, 최근의 도구는 원래 기술된 유전자 편집을 훨씬 뛰어넘어 적용되었습니다. CRISPR 활성화(CRISPRa) 시스템은 촉매 비활성 Cas9(dCas9) 단백질과 별개의 전사 모듈을 결합하여 내인성 유전자 발현을 유도합니다. SunTag-p65-HSF1(SPH)은 최근에 개발된 CRISPRa 기술로, 시너지 활성화 매개체(SAM)의 구성 요소와 SunTag 활성제를 결합합니다. 이 시스템은 맞춤형 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 설계하여 단일 또는 다중 유전자의 과발현을 허용합니다. 본 연구에서는 이전에 개발된 SPH 마우스를 사용하여 AdipoSPH라는 이름의 지방세포(adiponectin Cre lineage)에서 SPH를 발현하는 조건부 마우스를 생성하였다. 흰색에서 베이지색의 지방(갈변) 표현형을 유도하기 위해 내인성 Prdm16 유전자(갈색 및 베이지색 지방 발달과 관련된 잘 확립된 전사 인자)를 표적으로 하는 sgRNA를 운반하는 아데노 관련 바이러스(AAV)를 사타구니 백색 지방 조직(iWAT)에 주입했습니다. 이 마우스 모델은 내인성 Prdm16의 발현을 유도하고 열 발생 유전자 프로그램을 활성화시켰다. 또한, 시험관 내 SPH 유도 Prdm16 과발현은 베이지색 지방세포의 산소 소비를 향상시켜 이전 Prdm16 형질전환 마우스 모델의 결과를 표현화했습니다. 따라서 이 프로토콜은 지방 조직 생물학을 조사하기 위한 다재다능하고 비용 효율적이며 시간 효율적인 마우스 모델을 설명합니다.
서론
베이지색(또는 브라이트) 지방세포는 백색 지방 조직(WAT) 저장소 내에 존재하는 단백질 1(UCP1) 발현 및 미토콘드리아가 풍부한 지방세포의 결합을 해제합니다. 베이지색 지방은 저온 노출 및 기타 자극에 대한 반응으로 지방 세포 전구체 또는 성숙한 백색 지방 세포의 하위 집합에서 나옵니다 1,2. 베이지색 지방세포는 UCP1 의존적 또는 독립적인 방식으로 에너지를 열로 변환할 수 있다3. 열 발생 기능에 관계없이 베이지색 지방은 아디포카인 분비, 항염증 및 항섬유화 활동과 같은 다른 수단을 통해 대사 건강을 개선할 수도 있습니다. 생쥐와 인간을 대상으로 한 연구에 따르면 베이지색 지방을 유도하면 전신 포도당과 지질 항상성이 향상되는 것으로 나타났다3. 그러나 베이지색 지방 생물학에 대한 우리의 지식은 최근 몇 년 동안 빠르게 발전했지만 대부분의 대사 이점과 관련 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않았습니다.
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic repeats(CRISPR)는 Cas9 단백질
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프로토콜
동물 연구는 캄피나스 대학교 실험실 동물 관리 및 사용 가이드(프로토콜 CEUA #5810-1/2021)에 따라 수행되었습니다.
1. 분자 복제
- 단일 가이드 RNA(sgRNA)의 설계
- https://chopchop.cbu.uib.no/ 에서 구할 수 있는 CHOPCHOP 또는 기타 적절한 도구를 사용하여 CRISPR 활성화를 위한 sgRNA를 설계합니다. 다음 파라미터를 사용하여 Prdm16 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 설계합니다: 표적: Prdm16; 에서: Mus musculus; 사용: Crispr/Cas9; 대상: 활성화.
참고: 200bp 업스트림 전사 시작 부위(TSS) 영역에 걸쳐 분산된 각 관심 영역에 대한 sgRNA를 설계합니다. 예를 들어, 이 연구에 사용된 Prdm16을 표적으로 하는 sgRNA는 TSS의 상류에서 154bp에 결합합니다. - 벡터 백본 pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry의 SacI 제한 부위와 일치하도록 sgRNA에 돌출부를 추가합니다( 재료 표 참조). 포함: 5'-(N20)AGCT-3'(N = 뉴클레오티드). 예를 들어, Prdm16 유전자를 표적으로 하는 서열은 5'-CGA....
- https://chopchop.cbu.uib.no/ 에서 구할 수 있는 CHOPCHOP 또는 기타 적절한 도구를 사용하여 CRISPR 활성화를 위한 sgRNA를 설계합니다. 다음 파라미터를 사용하여 Prdm16 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 설계합니다: 표적: Prdm16; 에서: Mus musculus; 사용: Crispr/Cas9; 대상: 활성화.
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결과
AdipoSPH 마우스는 SPH 및 Adipoq-Cre 마우스 균주를 육종하여 개발되었습니다. 두 마우스 균주 모두 하이브리드 C57BL6J-DBA/2J 배경에 있었습니다(상용 공급업체에 따름, 재료 표 참조). SPH 마우스 계통은 원래 Zhou et al.14에 의해 설명되었습니다.
AdipoSPH 매개 Prdm16 과발현을 통한 생체 내 베이지 지방세포 발달
생체 내에서 베이지색 지방세포를 발달시키기 위해 본 연구에 기술된 모델의 능력을 평가하기 위해, Prdm16 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 운반하는 AAV를 AdipoSPH 마우스의 iWAT에 주입하였다. Prdm16은 베이지색 지방세포 발달 및 기능을 결정하는 잘 확립된 전사 인자입니다20,21
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토론
CRISPR 기술의 가장 유용한 비편집 응용 분야 중 하나는 CRISPRa 시스템을 사용하여 내인성 유전자의 활성화를 통한 유전자 기능의 조사입니다6. SPH는 강력한 CRISPRa로, 원래 여러 신경성 유전자를 표적으로 삼아 성상교세포를 활성 뉴런으로 전환시키는 것으로 기술되었다14. 이 연구에서 AdipoSPH는 지방 세포에서 내인성 Prdm16의 발현을 활성화하여 베이지색 지방 생물학을 조사하는 데 적합한 도구임이 입증되었습니다. 지방 세포에서 SPH-유도된 Prdm16 과발현은 열 발생 유전자 프로그램의 활성화를 유도하고, 갈변 표현형을 유도하여, 이전의 형질전환(Tg) Prdm16 마우스 모델을 표현복사한다23. Prdm16은 갈색 및 베이지색 지방 분화를 조절하는 이 전사 인자의 중심 역할과 분화된 지방 세포에서 열 발생 유전자 프로그램(예: Ucp1 발현 향상)의 조절을 기반으로 베이지색 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
저자들은 Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp, AdipoSPH 마우스 생성, Inmmunometabolism and Cell Signaling Laboratory, INFABIC(National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology)의 모든 실험 지원에 감사드립니다. 상파울루 연구 재단 (FAPESP)의 재정 지원에 감사드립니다 : 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 3,3',5-트리요오도-L-티로닌 | 시그마-알드리치 | T2877 | |
| 3-이소부틸-1-메틸크산틴 | 시그마-알드리치 | I5879 | |
| AAVpro 293T 세포주 | Takarabio | 632273 | |
| Amicon 초원심 필터 | Merckmillipore | UFC510008 | 100 KDa |
| 덱사메타손 | 시그마-알드리치 | D1756 | |
| Dulbecco의 Eagles Medium 변형 (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco의 변형 Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ 보충 | Gibco | 10565-018 | 고농도의 포도당, 아미노산, 및 비타민 |
| Dulbecco의 인산 완충 식염수 (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Excelta 자동 개방 마이크로 가위 | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
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| Fisherbrand 고정밀 직선 테이퍼드 초미세 포인트 핀셋/펜치 | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Fisherbrand 날카로운 해부 가위 | Fisher Scientific | 08-940 | |
| 글리세롤 | 시그마-알드리치 | G5516 | |
| HEPES | 시그마-알드리치 | H3375-25G | |
| 헥사디메트린 브로마이드(폴리브렌) | 시그마-알드리치 | H9268 | |
| 인도메타신 | 시그마-알드리치 | I7378 | |
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| pAAV2/8 | 애드진 | ||
| pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry | Addgene | 91947 | |
| pAdDeltaF6 | 애드진 | ||
| PEG 8000 | 시그마-알드리치 | 89510 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Gibco | 15140-122 | |
| 폴리에틸렌이민 | 시그마-알드리치 | 23966 | 선형, MW 25000 |
| 포비돈-요오드 | Rioquí 운모 | 510101303 | 방부제 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| SacI 효소 | New England Biolabs | R0156 | |
| Surgical Design Premier Adson Forceps | Fisher Scientific | 22-079-741 | |
| 주사기 | Hamilton | 475-40417 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M180B | |
| T4 DNA 리가제 완충액 | New England Biolabs | B0202S | |
| T4 PNK 효소 키트 | New England Biolabs | M0201S | |
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| Vidisic Gel | 바우쉬 + 롬브 | 99620 |
참고문헌
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 3....
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