Dissezione del tessuto pancreatico per isolare singole cellule vitali
Summary
Le cellule metaplastiche pancreatiche sono precursori di cellule maligne che danno origine ai tumori pancreatici. Tuttavia, isolare le cellule pancreatiche vitali intatte è difficile. Qui presentiamo un metodo efficiente per la dissociazione del tessuto pancreatico. Le cellule possono quindi essere utilizzate per il sequenziamento di RNA a singola cellula (scRNA-seq) o per la co-coltura bi- o tridimensionale.
Abstract
Il pancreas comprende due sistemi principali: il sistema endocrino, che produce e secerne ormoni, e il sistema esocrino, che rappresenta circa il 90% del pancreas e comprende cellule che producono e secernono enzimi digestivi. Gli enzimi digestivi sono prodotti nelle cellule acinose pancreatiche, immagazzinate in vescicole chiamate zimogeni, e vengono quindi rilasciati nel duodeno attraverso il dotto pancreatico per avviare i processi metabolici. Gli enzimi prodotti dalle cellule acinari possono uccidere le cellule o degradare l’RNA privo di cellule. Inoltre, le cellule acinari sono fragili e i comuni protocolli di dissociazione si traducono in un gran numero di cellule morte e proteasi e RNasi prive di cellule. Pertanto, una delle maggiori sfide nella digestione del tessuto pancreatico è il recupero di cellule intatte e vitali, in particolare cellule acinose. Il protocollo presentato in questo articolo mostra un metodo in due fasi che abbiamo sviluppato per soddisfare questa esigenza. Il protocollo può essere utilizzato per digerire la pancreata normale, la pancreata che include lesioni pre-maligne o i tumori pancreatici che includono un gran numero di cellule stromali e immunitarie.
Introduction
L’adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è uno dei tipi di cancro più aggressivi1. L’evidenza clinica supporta l’idea che il PDAC si sviluppi da cellule del sistema esocrino, comprese le cellule acinari, nel corso di molti anni, guidate da mutazioni nel proto-oncogeneKRAS 2.
I tumori del pancreas comprendono molti tipi di cellule diverse ed è stato dimostrato che le cellule maligne contano solo per il 20%-50% della massa tumorale3. Diversi tipi di cellule interagiscono con le cellule epiteliali, supportano la loro trasformazione e migliorano la formazione e la crescita del tumore. Gli eventi precoci causano metaplasia acinare, che dà origine a lesioni microscopiche chiamate neoplasia intraepiteliale pancreatica (PanINs), che in alcuni casi possono evolvere in PDAC4.
C’è una necessità critica di studiare queste interazioni e di individuare i segnali cardine. Il sequenziamento dell’RNA a singola cellula (scRNA-seq) è un potente metodo che rivela l’espressione genica con una risoluzione a singola cellula, monitorando così i cambiamenti che le cellule epiteliali subiscono, consentendo così l’esplorazione dello sviluppo del cancro al pancreas.
La dissezione e la digestione dei tessuti in singole cellule è la prima fase di un esperimento scRNA-seq. Diversi fattori rendono la digestione del tessuto pancreatico particolarmente impegnativa: i) le cellule acinari rappresentano oltre il 90% del pancreas e le cellule acinari contengono grandi quantità di enzimi digestivi, tra cui proteasi e RNasi che riducono la qualità delle librerie basate sull’RNA; (ii) le cellule acinari sono molto sensibili e possono lisare se vengono utilizzati protocolli standard; (iii) le cellule acinari esprimono un piccolo numero di geni a livelli molto elevati. Pertanto, se queste cellule vengono lisate durante l’esperimento, questo può contaminare il profilo di espressione genica osservato di altre cellule; (iv) il tessuto pancreatico recuperato dai tumori è desmoplastico, il che lo rende difficile da sezionare senza danneggiare le cellule. Pertanto, anche se è necessario mantenere un’elevata vitalità di tutti i tipi di cellule, il gran numero e la sensibilità delle cellule acinari aggiungono ulteriore complessità. Questi fattori impongono difficoltà nel raggiungere una sospensione a singola cellula che sia vitale per oltre l’80% e non abbia grumi, come richiesto per gli esperimenti scRNA-seq.
Qui, abbiamo sviluppato un protocollo che utilizza tripsina C e collagenasi P, insieme a un frequente monitoraggio dei tessuti. Ciò supporta la dissociazione in singole cellule pur mantenendo un’elevata vitalità per supportare il successo degli esperimenti scRNA-seq 5,6.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo articolo presentiamo un protocollo per la dissociazione del tessuto pancreatico. Il protocollo è semplice, facile da usare e fornisce uno strumento per isolare singole cellule vitali dal tessuto pancreatico in diverse fasi del processo di malignità, compresi i tumori solidi. In studi precedenti, diversi tipi di collagenasi sono stati utilizzati per digerire il pancreas 8,9. L’uso di una collagenasi molto potente, come la collagenasi D, si traduce in u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il Dr. Avital Sarusi-Portuguez per l’aiuto nell’analisi dei dati e il Dr. Dror Kolodkin-Gal per l’assistenza nello stabilire il protocollo in uno studio precedente. Ringraziamo tutti i membri passati e presenti del laboratorio Parnas. Ringraziamo la Dott.ssa Gillian Kay e il Dott. Michael Kanovsky per il loro aiuto nell’editing. Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dalla sovvenzione della Israel Science Foundation (n. 526/18 O.P.), dal programma Alex U. Soyka e da una sovvenzione dell’Israel Cancer Research Fund (Research Career Development Award).
Materials
| Reagent or Resource | |||
| 70 µm nylon mesh | Corning | cat##431751 | |
| BSA | Sigma Aldrich | cat# A7906 | |
| Collagenase P | Roche | cat# 11213857001 | |
| Critical Commercial Assay | |||
| DAPI | Sigma Aldrich | cat#MBD0015 | |
| Dnase I | Roche | cat# 10104159001 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Fetal Bovine Serum South American | ThermoFisher | Cat#10270106 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Biological industries | cat#02-018-1A | |
| KRASLSL-G12D mice | Jackson Laboratory | JAX008179 | |
| MACS dead cells removal kit | Milteny Biotec | cat#130-090-101 | |
| PBS | Biological industries | cat#02-023-1A | |
| Ptf1a-CreER mice | Jackson Laboratory | JAX019378 | |
| Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX007908 | |
| Trypsin C-EDTA 0.05% | Biological industries | cat# 03-053-1A | |
| Trypsin inhibitor | Roche | cat#T6522 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Peng, J., et al. Author correction: single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Research. 29 (9), 777 (2019).
- Hruban, R. H., Wilentz, R. E., Kern, S. E. Genetic progression in the pancreatic ducts. The American Journal of Pathology. 156 (6), 1821-1825 (2000).
- Schlesinger, Y., et al. Single-cell transcriptomes of pancreatic preinvasive lesions and cancer reveal acinar metaplastic cells’ heterogeneity. Nature Communications. 11 (1), 4516 (2020).
- Kolodkin-Gal, D., et al. Senolytic elimination of Cox2-expressing senescent cells inhibits the growth of premalignant pancreatic lesions. Gut. 71 (2), 345-355 (2021).
- Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
- Elyada, E., et al. Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts. Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).
- Bernard, V., et al. Single-cell transcriptomics of pancreatic cancer precursors demonstrates epithelial and microenvironmental heterogeneity as an early event in neoplastic progression. Clinical Cancer Research. 25 (7), 2194-2205 (2019).
- Moncada, R., et al. Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas. Nature Biotechnology. 38 (3), 333-342 (2020).
- Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptome profiling of pancreatic cancer identifies multicellular dynamics associated with neoadjuvant treatment. Nature Genetics. 54 (8), 1178-1191 (2022).
- Cui Zhou, D., et al. Spatially restricted drivers and transitional cell populations cooperate with the microenvironment in untreated and chemo-resistant pancreatic cancer. Nature Genetics. 54 (9), 1390-1405 (2022).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
