Ein einfaches Protokoll zur Kartierung der Architekturmerkmale des Pflanzenwurzelsystems
Summary
Wir verwenden einfache Laborwerkzeuge, um die Wurzelsystemarchitektur (RSA) von Arabidopsis und Medicago zu untersuchen. Die Pflänzchen werden hydroponisch über Mesh gezüchtet und mit einem Kunstpinsel verteilt, um die RSA freizulegen. Die Bilder werden mit Hilfe eines Scans oder einer hochauflösenden Kamera aufgenommen und dann mit ImageJ analysiert, um Merkmale zu kartieren.
Abstract
Umfassende Kenntnisse über die Entwicklung der Architektur des Pflanzenwurzelsystems (RSA) sind entscheidend für die Verbesserung der Nährstoffnutzungseffizienz und die Erhöhung der Toleranz der Pflanzensorten gegenüber Umweltherausforderungen. Es wird ein experimentelles Protokoll für den Aufbau des hydroponischen Systems, das Wachstum der Pflänzchen, die RSA-Ausbreitung und die Bildgebung vorgestellt. Der Ansatz verwendete ein magentafarbenes, kastenbasiertes hydroponisches System, das Polypropylengewebe enthält, das von Polycarbonatkeilen getragen wird. Experimentelle Settings werden beispielhaft durch die Bewertung der RSA der Pflänzchen unter variierender Nährstoffversorgung (Phosphat [Pi]) veranschaulicht. Das System wurde entwickelt, um die RSA von Arabidopsis zu untersuchen, aber es ist leicht anpassbar, um andere Pflanzen wie Medicago sativa (Alfalfa ) zu untersuchen. Arabidopsis thaliana (Col-0) Pflänzchen werden in dieser Untersuchung als Beispiel verwendet, um die Pflanze RSA zu verstehen. Das Saatgut wird durch Behandlung mit Ethanol und verdünntem handelsüblichem Bleichmittel oberflächensterilisiert und zur Stratifizierung bei 4 °C gehalten. Die Samen werden gekeimt und auf einem flüssigen Halb-MS-Medium auf einem Polypropylengewebe gezüchtet, das von Polycarbonatkeilen getragen wird. Die Pflänzchen werden unter Standard-Wachstumsbedingungen für die gewünschte Anzahl von Tagen gezüchtet, vorsichtig aus dem Netz gepflückt und in wasserhaltige Agarplatten getaucht. Jedes Wurzelsystem der Pflänzchen wird mit Hilfe eines runden Kunstpinsels sanft auf der mit Wasser gefüllten Platte verteilt. Diese Petriplatten werden mit hoher Auflösung fotografiert oder gescannt, um die RSA-Merkmale zu dokumentieren. Die Wurzelmerkmale, wie Primärwurzel, Seitenwurzeln und Verzweigungszone, werden mit der frei verfügbaren Software ImageJ gemessen. In dieser Studie werden Techniken zur Messung von Pflanzenwurzelmerkmalen in kontrollierten Umweltumgebungen vorgestellt. Wir diskutieren, wie man (1) die Pflänzchen züchtet und Wurzelproben sammelt und verteilt, (2) Bilder von ausgebreiteten RSA-Proben erhält, (3) die Bilder erfasst und (4) Bildanalysesoftware verwendet, um Wurzelattribute zu quantifizieren. Der Vorteil der vorliegenden Methode liegt in der vielseitigen, einfachen und effizienten Messung der RSA-Merkmale.
Introduction
Die unterirdische Wurzelsystemarchitektur (RSA) ist ein wichtiges Organ für das Wachstum und die Produktivität von Pflanzen 1,2,3. Nach dem Embryonalstadium durchlaufen Pflanzen ihre wichtigsten morphologischen Veränderungen. Die Art und Weise, wie die Wurzeln im Boden wachsen, hat einen großen Einfluss auf das Wachstum von Pflanzenteilen über der Erde. Das Wurzelwachstum ist der erste Schritt in der Keimung. Es ist ein informatives Merkmal, da es auf einzigartige Weise auf verschiedene verfügbare Nährstoffe reagiert 1,2,3,4. Die RSA weist ein hohes Maß an Entwicklungsplastizität auf, was bedeutet, dass die Umgebung immer verwendet wird, um Entscheidungen über die Entwicklung zu treffen 2,5. Veränderungen in der Umwelt haben die Pflanzenproduktion im gegenwärtigen Szenario erschwert. Die RSA bezieht kontinuierlich Umweltsignale in Entwicklungsentscheidungen ein5. Daher ist ein gründliches Verständnis der Prinzipien, die der Wurzelentwicklung zugrunde liegen, unerlässlich, um zu lernen, wie Pflanzen auf sich verändernde Umweltbedingungen reagieren 2,5.
Der RSA erkennt variierende Nährstoffkonzentrationen und gibt phänotypische Veränderungen wieder: 4,6,7,8,9,10,11,12. Studien deuten darauf hin, dass die Wurzelmorphologie/RSA im Vergleich zur Sprossmorphologie sehr plastisch ist 1,3. Die Kartierung von RSA-Merkmalen ist sehr effektiv bei der Erfassung der Auswirkungen der Veränderung der umgebenden Bodenumgebung 1,11,12.
Im Allgemeinen wurden in vielen früheren Studien Diskrepanzen in der Wirkung verschiedener Nährstoffmängel auf den Wurzelphänotyp berichtet 3,11,13,14,15. Zum Beispiel gibt es mehrere gegensätzliche Berichte über Phosphat (Pi)-Hunger induzierte Veränderungen in der Anzahl, Länge und Dichte der Seitenwurzeln (LRs). Eine Zunahme der LR-Dichte wurde unter der Pi-Mangelbedingung 6,8 berichtet. Im Gegensatz dazu wurde auch von anderen Autoren über eine Abnahme der LR-Dichte unter Pi-defizienten Bedingungen berichtet 3,13,16. Eine der Hauptursachen für diese Inkonsistenzen ist die Verwendung des elementaren kontaminationsanfälligen Geliermediums, das Agar oftenthält 10. Forscher züchten ihre Versuchspflanzen in der Regel auf einem Plattensystem auf Agarbasis und zeichnen die Wurzelmerkmale auf. Zahlreiche RSA-Merkmale sind häufig im Agarmaterial verborgen oder verankert und können nicht dokumentiert werden. Experimente im Zusammenhang mit der Induktion eines Nährstoffmangels, bei denen Anwender häufig eine Komponente vollständig aus dem Medium ausschließen, können in elementar kontaminationsanfälligem Geliermedium nicht durchgeführt werden11,14,15. Zahlreiche Nährstoffe sind häufig in signifikanten Mengen in den Agarmedien vorhanden, darunter P, Zn, Fe und viele mehr11,14,15. Darüber hinaus ist das RSA-Wachstum in agarbasierten Medien langsamer als in flüssigen Medien ohne Agar. Daher besteht die Notwendigkeit, einen alternativen, nicht-agar-basierten Ansatz zur Quantifizierung und qualitativen Erfassung des Phänotyps von RSA zu etablieren. Folglich wurde die aktuelle Methode entwickelt, bei der Pflänzchen in einem magentafarbenen, kastenbasierten hydroponischen System auf einem Polypropylennetz aufgezogen werden, das von Polycarbonatkeilengetragen wird 1,10,11.
Diese Studie präsentiert eine detaillierte improvisierte Version der früheren Methode, die von Jain et al.10 beschrieben wurde. Diese Strategie wurde auf die aktuellen Anforderungen in der Pflanzenwurzelbiologie abgestimmt und kann auch für andere Pflanzen wie Luzerne als Modellpflanzen verwendet werden. Das Protokoll ist die primäre Methode, um die Änderungen in RSA zu messen, und es erfordert nur einfache Geräte. Das vorliegende Protokoll veranschaulicht die Phänotypisierung verschiedener Wurzelmerkmale, wie z.B. Primär- und Seitenwurzeln in normalem und modifiziertem Medium (Pi-defizient). Schritt-für-Schritt-Anleitungen und andere hilfreiche Hinweise, die aus den Erfahrungen des Autors gewonnen wurden, werden bereitgestellt, um den Forschern zu helfen, den in dieser Methode angebotenen Methoden zu folgen. Ziel der vorliegenden Studie ist es, eine einfache und effektive Methode zur Aufdeckung des gesamten Wurzelsystems von Pflanzen, einschließlich LRs höherer Ordnung, bereitzustellen. Bei dieser Methode wird das Wurzelsystem manuell mit einem runden Aquarellpinsel verteilt, was eine präzise Kontrolle über die Belichtung der Wurzeln ermöglicht 1,10,11,12. Es erfordert keine teure Ausrüstung oder komplizierte Software. Diese Methode hat die Nährstoffaufnahme und die Wachstumsrate verbessert; Pflanzen haben eine nährstoffreiche Lösung, die leicht von ihren Wurzeln aufgenommen wird. Die vorliegende Methode eignet sich für Forscher, die die Merkmale des Wurzelsystems einer Pflanze detailliert kartieren möchten, insbesondere während der frühen Entwicklung (10-15 Tage nach der Keimung). Es eignet sich für kleine Wurzelsysteme, Modellpflanzen wie Arabidopsis und Tabak und unkonventionelle Pflanzen wie Luzerne, bis ihr Wurzelsystem in die magentafarbenen Boxen passt.
Die Schritte zur phänotypischen Analyse der RSA-Entwicklung in Arabidopsis werden in diesem Protokoll wie folgt beschrieben: (1) die Methode der Sterilisation der Samenoberfläche für Pflanzen (Arabidopsis), (2) die Schritte zum Aufbau des hydroponischen Systems, gefolgt von der Aussaat des Saatguts auf einem Medium, (3) Verfahren zum Herausnehmen der vollständigen Aussaat und zum Verteilen auf der Petriplatte für die RSA-Analyse, (4) wie man die Bilder für RSA aufzeichnet und (5) wie man wichtige RSA-Parameter mit der ImageJ-Software berechnet.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Arbeit wurde die Kartierung von RSA mit einfachen Laborgeräten demonstriert. Mit dieser Methode werden phänotypische Veränderungen auf der verfeinerten Ebene erfasst. Der Vorteil dieser Strategie besteht darin, dass der Sprossteil nie mit dem Medium in Berührung kommt, so dass der Phänotyp der Pflänzchen ursprünglich ist. Bei dieser Methode wird ein hydroponisches System eingerichtet, um Pflänzchen zu züchten, wie im Protokoll beschrieben. Dann wird jedes Pflänzchen unversehrt herausgenommen und auf e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem U.S. Department of Agriculture (Grant 58-6406-1-017) für die Unterstützung dieser Forschung. Wir danken auch dem WKU Biotechnology Centre, Western Kentucky University, Bowling Green, KY, USA, und dem Direktor, CSIR Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants, Lucknow, Indien, für die Bereitstellung der Geräteausstattung und Unterstützung (CSIR CIMAP-Manuskriptmitteilung Nr. CIMAP/PUB/2022/103). SS bedankt sich für die finanzielle Unterstützung durch die Saint Joseph’s University, Philadelphia, USA.
Materials
| Arabidospsis thaliana (Col 0) | Lehle Seeds | WT-02 | Columbia (Col-0**, no markers)* |
| Art brushes | Amazon or any other vendor | Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm) | |
| Automated Microscope with digital camera | Leica Microsystems | LAS version 4.12.0, Leica Microsystems | |
| Imaging Software | ImageJ | ImageJ V 1.8.0 |
|
| Magenta box GA-7 | Fisher Scientific | 50-255-176 | |
| Medicago sativa | Johnny's Seeds | ||
| Petri-plate (150 mm x 15 mm) | USA Scientific | 8609-0215 | 150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com) |
| Photo camera | Cannon or Nikon | Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode | |
| Plant-Agar | Sigma-Aldrich | A3301 | Agargel Suitable for plant tissue culture |
| Polycarbonate Sheets | Amazon | 1 mm thick | |
| Polypropylene Mesh | Amazon | Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm | |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi) |
References
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