Bitki kök sistemi mimari özelliklerini haritalamak için basit bir protokol
Summary
Arabidopsis ve Medicago’nun kök sistem mimarisini (RSA) incelemek için basit laboratuvar araçları kullanıyoruz. Fideler ağ üzerinde hidroponik olarak yetiştirilir ve RSA’yı ortaya çıkarmak için bir sanat fırçası kullanılarak yayılır. Görüntüler tarama veya yüksek çözünürlüklü bir kamera kullanılarak alınır, daha sonra özellikleri haritalamak için ImageJ ile analiz edilir.
Abstract
Bitki kök sistemi mimarisi (RSA) geliştirme hakkında kapsamlı bilgi, besin kullanım verimliliğini artırmak ve mahsul çeşidinin çevresel zorluklara karşı toleransını artırmak için kritik öneme sahiptir. Hidroponik sistemin kurulması, plantlet büyümesi, RSA yayılımı ve görüntüleme için deneysel bir protokol sunulmaktadır. Yaklaşım, polikarbonat kamalarla desteklenen polipropilen ağ içeren macenta kutu tabanlı bir hidroponik sistem kullandı. Deneysel ortamlar, çeşitli besin (fosfat [Pi]) kaynağı altında plantletlerin RSA’sının değerlendirilmesiyle örneklendirilmiştir. Sistem, Arabidopsis’in RSA’sını incelemek için kuruldu, ancak Medicago sativa (Yonca) gibi diğer bitkileri incelemek için kolayca uyarlanabilir. Arabidopsis thaliana (Col-0) plantletleri bu araştırmada RSA bitkisini anlamak için bir örnek olarak kullanılmıştır. Tohumlar, etanol ve seyreltilmiş ticari ağartıcı muamelesi yapılarak yüzey sterilize edilir ve tabakalaşma için 4 ° C’de tutulur. Tohumlar çimlenir ve polikarbonat kamalarla desteklenen bir polipropilen ağ üzerinde sıvı bir yarım MS ortamında yetiştirilir. Fideletler, istenen sayıda gün boyunca standart büyüme koşulları altında yetiştirilir, ağdan yavaşça toplanır ve su içeren agar plakalarına batırılır. Plantletlerin her kök sistemi, yuvarlak bir sanat fırçası yardımıyla su dolu plakaya yavaşça yayılır. Bu Petri plakaları, RSA özelliklerini belgelemek için yüksek çözünürlükte fotoğraflanır veya taranır. Birincil kök, yanal kökler ve dallanma bölgesi gibi kök özellikleri, serbestçe kullanılabilen ImageJ yazılımı kullanılarak ölçülür. Bu çalışma, kontrollü çevresel ortamlarda bitki kök özelliklerini ölçmek için teknikler sunmaktadır. (1) bitki yavrularının nasıl yetiştirileceğini ve kök örneklerinin nasıl toplanacağını ve yayılacağını, (2) yayılmış RSA örneklerinin resimlerini nasıl elde edeceğinizi, (3) görüntüleri nasıl yakalayacağımızı ve (4) kök özniteliklerini ölçmek için görüntü analiz yazılımının nasıl kullanılacağını tartışıyoruz. Mevcut yöntemin avantajı, RSA özelliklerinin çok yönlü, kolay ve verimli bir şekilde ölçülmesidir.
Introduction
Yeraltında bulunan kök sistem mimarisi (RSA), bitki büyümesi ve verimliliği için hayati bir organdır 1,2,3. Embriyonik aşamadan sonra, bitkiler en önemli morfolojik değişikliklerine uğrarlar. Köklerin toprakta yetişme şekli, bitki parçalarının toprak üzerindeki büyümesini büyük ölçüde etkiler. Kök büyümesi çimlenmede ilk adımdır. Mevcut farklı besin maddelerine benzersiz bir şekilde yanıt verdiği için bilgilendirici bir özelliktir 1,2,3,4. RSA, yüksek derecede gelişimsel plastisite sergiler, bu da çevrenin her zaman gelişim 2,5 hakkında karar vermek için kullanıldığı anlamına gelir. Çevredeki değişiklikler, mevcut senaryoda mahsul üretimini daha da zorlaştırmıştır. RSA, çevresel sinyalleri gelişimsel seçimlere sürekli olarak dahil eder5. Sonuç olarak, kök gelişiminin ardındaki ilkelerin tam olarak anlaşılması, bitkilerin değişen ortamlara nasıl tepki verdiğini öğrenmek için gereklidir 2,5.
RSA, değişen besin konsantrasyonlarını algılar ve fenotipik değişiklikleri 4,6,7,8,9,10,11,12 yapar. Çalışmalar, kök morfolojisinin / RSA’nın sürgün morfolojisine kıyasla oldukça plastik olduğunu göstermektedir 1,3. RSA özellik haritalaması, çevredeki toprak ortamını değiştirmenin etkisini kaydetmede oldukça etkilidir 1,11,12.
Genel olarak, çeşitli besin eksikliklerinin kök fenotipi üzerindeki etkisindeki tutarsızlıklar daha önceki birçok çalışmada bildirilmiştir 3,11,13,14,15. Örneğin, yanal köklerin (LR’ler) sayısında, uzunluğunda ve yoğunluğunda fosfat (Pi) açlığına bağlı değişiklikler hakkında birkaç zıt rapor vardır. Pi eksikliği durumu 6,8 altında LR yoğunluğunda bir artış bildirilmiştir. Buna karşılık, Pi eksikliği koşulları altında LR yoğunluğunda bir azalma diğer yazarlar tarafından da bildirilmiştir 3,13,16. Bu tutarsızlıkların öne çıkan nedenlerinden biri, agarın sıklıkla10 içerdiği elementel kontaminasyona eğilimli jelleşme ortamının kullanılmasıdır. Araştırmacılar tipik olarak deneysel bitkilerini agar bazlı bir plaka sistemi üzerinde yetiştirir ve kök özelliklerini kaydeder. Çok sayıda RSA özelliği sıklıkla agar materyali içinde gizlenir veya yerleşir ve belgelenemez. Kullanıcıların genellikle bir bileşeni ortamdan tamamen dışladığı besin eksikliğini indüklemeyle bağlantılı deneyler, elementel kontaminasyona eğilimli jelleşme ortamı11,14,15’te gerçekleştirilemez. Agar ortamında, P, Zn, Fe ve daha birçok11,14,15 dahil olmak üzere çok sayıda besin maddesi sıklıkla önemli miktarlarda bulunur. Ayrıca, RSA büyümesi agar bazlı ortamlarda, agar bazlı olmayan sıvı ortama göre daha yavaştır. Sonuç olarak, RSA’nın fenotipini ölçmek ve nitel olarak kaydetmek için alternatif bir agar tabanlı olmayan yaklaşım oluşturmaya ihtiyaç vardır. Sonuç olarak, plantletlerin polikarbonat kamalar 1,10,11 ile desteklenen bir polipropilen ağın üzerinde macenta kutu bazlı bir hidroponik sistemde yetiştirildiği mevcut yöntem geliştirilmiştir.
Bu çalışma, Jain ve ark.10 tarafından açıklanan daha önceki yöntemin ayrıntılı bir doğaçlama versiyonunu sunmaktadır. Bu strateji, bitki kök biyolojisindeki mevcut talepler için ayarlanmıştır ve model bitkiler dışındaki Yonca gibi bitkiler için de kullanılabilir. Protokol, RSA’daki değişiklikleri ölçmenin birincil yoludur ve yalnızca basit ekipman gerektirir. Mevcut protokol, normal ve modifiye edilmiş ortamda (Pi eksikliği) birincil ve lateral kökler gibi çeşitli kök özelliklerinin nasıl fenotiplendirileceğini göstermektedir. Yazarın deneyimlerinden toplanan adım adım talimatlar ve diğer yararlı ipuçları, araştırmacıların bu yöntemde sunulan metodolojilerle birlikte takip etmelerine yardımcı olmak için sağlanmıştır. Bu çalışma, yüksek dereceli LR’ler de dahil olmak üzere bitkilerin tüm kök sistemini ortaya çıkarmak için basit ve etkili bir yöntem sunmayı amaçlamaktadır. Bu yöntem, kök sisteminin yuvarlak bir suluboya sanat fırçası ile manuel olarak yayılmasını içerirve köklerin maruz kalması üzerinde hassas kontrol sağlar 1,10,11,12. Pahalı ekipman veya karmaşık yazılım gerektirmez. Bu yöntem, besin alımını ve büyüme oranını iyileştirmiştir; Bitkiler, kökleri tarafından kolayca emilen besin açısından zengin bir çözeltiye sahiptir. Mevcut yöntem, bir bitkinin kök sisteminin özelliklerini, özellikle erken gelişim sırasında (çimlenmeden 10-15 gün sonra) ayrıntılı olarak haritalamak isteyen araştırmacılar için uygundur. Küçük kök sistemleri, Arabidopsis ve tütün gibi model bitkiler ve kök sistemleri macenta kutularına sığana kadar Yonca gibi geleneksel olmayan bitkiler için uygundur.
Arabidopsis’te RSA gelişiminin fenotipik analizi için adımlar bu protokolde şu şekilde özetlenmiştir: (1) bitkiler için tohum yüzeyi sterilizasyonu yöntemi (Arabidopsis), (2) hidroponik sistemi kurma adımları, ardından bir ortamda tohum ekimi, (3) tüm tohumların çıkarılması ve RSA analizi için Petri plakasına yayılması prosedürü, (4) RSA için görüntülerin nasıl kaydedileceği ve (5) ImageJ yazılımını kullanarak önemli RSA parametrelerinin hesaplanması.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma, RSA’nın basit laboratuvar ekipmanlarını kullanarak haritalandırıldığını göstermiştir. Bu yöntemi kullanarak, fenotipik değişiklikler rafine seviyede kaydedilir. Bu stratejinin yararı, sürgün kısmının asla medya ile temas etmemesidir, bu nedenle plantletlerin fenotipi orijinaldir. Bu yöntem, protokolde açıklandığı gibi plantlet yetiştirmek için bir hidroponik sistem kurmayı içerir. Daha sonra, her plantlet bozulmadan çıkarılır ve agar dolu bir Petri plakasına yerleştirili…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırmayı desteklediği için ABD Tarım Bakanlığı’na (Grant 58-6406-1-017) teşekkür ederiz. Ayrıca, WKU Biyoteknoloji Merkezi, Western Kentucky Üniversitesi, Bowling Green, KY, ABD ve CSIR Merkezi Tıbbi ve Aromatik Bitkiler Enstitüsü, Lucknow, Hindistan’a enstrüman olanakları ve desteği sağladığı için teşekkür ederiz (CSIR CIMAP el yazması iletişim no. CIMAP/PUB/2022/103). SS, Saint Joseph Üniversitesi, Philadelphia, ABD’den gelen mali desteği kabul eder.
Materials
| Arabidospsis thaliana (Col 0) | Lehle Seeds | WT-02 | Columbia (Col-0**, no markers)* |
| Art brushes | Amazon or any other vendor | Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm) | |
| Automated Microscope with digital camera | Leica Microsystems | LAS version 4.12.0, Leica Microsystems | |
| Imaging Software | ImageJ | ImageJ V 1.8.0 |
|
| Magenta box GA-7 | Fisher Scientific | 50-255-176 | |
| Medicago sativa | Johnny's Seeds | ||
| Petri-plate (150 mm x 15 mm) | USA Scientific | 8609-0215 | 150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com) |
| Photo camera | Cannon or Nikon | Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode | |
| Plant-Agar | Sigma-Aldrich | A3301 | Agargel Suitable for plant tissue culture |
| Polycarbonate Sheets | Amazon | 1 mm thick | |
| Polypropylene Mesh | Amazon | Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm | |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi) |
References
- Shukla, D., Rinehart, C. A., Sahi, S. V. Comprehensive study of excess phosphate response reveals ethylene mediated signaling that negatively regulates plant growth and development. Scientific Reports. 7 (1), 3074 (2017).
- Rellán-Álvarez, R., Lobet, G., Dinneny, J. R. Environmental control of root system biology. Annual Review of Plant Biology. 67, 619-642 (2016).
- Gruber, B. D., Giehl, R. F. H., Friedel, S., von Wirén, N. Plasticity of the Arabidopsis root system under nutrient deficiencies. Plant Physiology. 163 (1), 161-179 (2013).
- Shukla, D., et al. Genome-wide expression analysis reveals contrasting regulation of phosphate starvation response (PSR) in root and shoot of Arabidopsis and its association with biotic stress. Environmental and Experimental Botany. , 188 (2021).
- Robbins 2nd, ., E, N., Dinneny, J. R. Growth is required for perception of water availability to pattern root branches in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), E822-E831 (2018).
- Linkohr, B. I., Williamson, L. C., Fitter, A. H., Leyser, H. M. O. Nitrate and phosphate availability and distribution have different effects on root system architecture of Arabidopsis. The Plant Journal. 29 (6), 751-760 (2002).
- Lynch, J. P., Brown, K. M. Topsoil foraging: an architectural adaptation of plants to low phosphorus availability. Plant and Soil. 237 (2), 225-237 (2001).
- López-Bucio, J., et al. Phosphate availability alters architecture and causes changes in hormone sensitivity in the Arabidopsis root system. Plant Physiology. 129 (1), 244-256 (2002).
- Jain, A., et al. Differential effects of sucrose and auxin on localized phosphate deficiency-induced modulation of different traits of root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 144 (1), 232-247 (2007).
- Jain, A., et al. Variations in the composition of gelling agents affect morphophysiological and molecular responses to deficiencies of phosphate and other nutrients. Plant Physiology. 150 (2), 1033-1049 (2009).
- Jain, A., Sinilal, B., Dhandapani, G., Meagher, R. B., Sahi, S. V. Effects of deficiency and excess of zinc on morphophysiological traits and spatiotemporal regulation of zinc-responsive genes reveal incidence of cross talk between micro- and macronutrients. Environmental Science and Technology. 47 (10), 5327-5335 (2013).
- Jain, A., et al. Role of Fe-responsive genes in bioreduction and transport of ionic gold to roots of Arabidopsis thaliana during synthesis of gold nanoparticles. Plant Physiology and Biochemistry. 84, 189-196 (2014).
- Williamson, L. C., Ribrioux, S. P., Fitter, A. H., Leyser, H. M. Phosphate availability regulates root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 126 (2), 875-882 (2001).
- Yang, T. J. W., Lin, W. D., Schmidt, W. Transcriptional profiling of the Arabidopsis iron deficiency response reveals conserved transition metal homeostasis networks. Plant Physiology. 152 (4), 2130 (2010).
- Kobae, Y., et al. Zinc transporter of Arabidopsis thaliana AtMTP1 is localized to vacuolar membranes and implicated in zinc homeostasis. Plant Cell and Physiology. 45 (12), (2004).
- Al-Ghazi, Y., et al. Temporal responses of Arabidopsis root architecture to phosphate starvation: evidence for the involvement of auxin signalling. Plant, Cell and Environment. 26 (7), 1053-1066 (2003).
- S, U. . National Institutes of Health. , 1997-2007 (1997).
- Dubrovsky, J. G., Forde, B. G. Quantitative analysis of lateral root development: pitfalls and how to avoid them. The Plant Cell. 24 (1), 4-14 (2012).
- Weeks, J. T., Ye, J., Rommens, C. M. Development of an in planta method for transformation of Alfalfa (Medicago sativa). Transgenic Research. 17 (4), 587-597 (2008).
- Shukla, D., Krishnamurthy, S., Sahi, S. V. Microarray analysis of Arabidopsis under gold exposure to identify putative genes involved in the synthesis of gold nanoparticles (AuNPs).Genomics Data. 3, 100-102 (2015).
