זיהוי הגנים המעורבים בהתפתחות סטומאטלית באמצעות ניקוד פנוטיפ אפידרמלי
Summary
מאמר זה מתאר שתי שיטות פנוטיפ ללא שימוש בקליפות אפידרמיס כדי לאפיין את הגנים השולטים בהתפתחות הסטומטלית. השיטה הראשונה מדגימה כיצד לנתח פנוטיפ סטומטלי באמצעות אפידרמיס צמחי מוכתם O כחול טולוידין. השיטה השנייה מתארת כיצד לזהות ליגנדות סטומטיות ולנטר את פעילותן הביולוגית.
Abstract
סטומטות הן נקבוביות קטנות על פני השטח של צמחי יבשה המעורבות בחילופי גזים ובשחרור אדי מים, ותפקידן קריטי לפריון הצמח ולהישרדותו. ככזו, להבנת המנגנונים שבאמצעותם מתפתחות ותבניות הפיוניות יש ערך אגרונומי עצום. מאמר זה מתאר שתי שיטות פנוטיפיות המשתמשות בקוטילדונים Arabidopsis שניתן להשתמש בהן כדי לאפיין את הגנים השולטים בהתפתחות ובתבניות סטומטליות. תחילה מוצגים נהלים לניתוח הפנוטיפים הסטומאטליים באמצעות cotyledons מוכתמים O כחול toluidine. שיטה זו מהירה ואמינה ואינה דורשת שימוש בקליפות אפידרמיס, הנמצאות בשימוש נרחב לניתוחים פנוטיפיים אך דורשות הכשרה מיוחדת. בשל נוכחותן של שאריות ציסטאין מרובות, הזיהוי והייצור של פפטידים ביו-אקטיביים מסוג EPF שיש להם תפקיד בהתפתחות סטומטלית היו מאתגרים. לפיכך, השני הוא הליך המשמש לזיהוי ליגנדות stomatal וניטור הפעילות הביולוגית שלהם על ידי bioassays. יתרונה העיקרי של שיטה זו הוא בכך שהיא מפיקה נתונים הניתנים לשחזור בקלות יחסית, תוך הפחתת כמות תמיסת הפפטיד והזמן הנדרש לאפיון תפקידם של הפפטידים בשליטה על דפוס סטומטלי והתפתחותו. בסך הכל, פרוטוקולים מתוכננים היטב אלה משפרים את היעילות של לימוד הרגולטורים הסטומאטליים הפוטנציאליים, כולל פפטידים מפרישים עשירים בציסטאין, הדורשים מבנים מורכבים ביותר לפעילותם.
Introduction
דפוסים והתמיינות נכונים של הפיוניות של הצמח הם קריטיים לתפקודם בשני תהליכים ביולוגיים בסיסיים, פוטוסינתזה וטרנספירציה, והם נאכפים על ידי מסלולי איתות פפטידים EPF. בארבידופסיס, שלושה פפטידים עשירים בציסטאין המופרשים, EPF1, EPF2 ו-STOMAGEN/EPFL9, שולטים בהיבטים שונים של התפתחות סטומטית ונתפסים על ידי רכיבי קולטן פני השטח של התא, כולל קינאזות קולטן ממשפחת ERECTA (ER, ERL1 ו-ERL2), SERK ו-TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . הכרה זו מובילה לאחר מכן להפחתת הרגולציה של גורמי השעתוק המקדמים התמיינות סטומטית בתהליך תלוי MAPK11. הגילוי של גנים סטומטיים מרכזיים אלה מושג בעיקר על ידי סינון פנוטיפי של מוטנטים המציגים פגמים אפידרמיסים. מאמר זה מציג שיטות פנוטיפ פשוטות ויעילות יחסית להדמיית הפיוניות ותאי אפידרמיס אחרים, הנדרשות כדי לזהות ולאפיין את הגנים הפוטנציאליים השולטים בתבניות ובהתמיינות הסטומטלית.
התצפית על פרטי האפידרמיס של הצמח הושגה בדרך כלל באמצעות קליפות אפידרמיס עם או בלי כתמים בצבע כגון toluidine blue O (TBO) או ספרנין12,13,14. עם זאת, האתגר העיקרי של שיטות אלה הוא שהן דורשות הכשרה מיוחדת כדי לקלף את אפידרמיס העלה מבלי לקרוע את הרקמות ולהתבונן ולנתח בקפידה את נתוני הדפוסים תוך הימנעות מתמונות שצולמו מחלקים שונים של העלה. טיפולים כימיים לניקוי דגימות הרקמה באמצעות ריאגנטים כגון תמיסות ניקוי מבוססות כלורל הידרט היו בשימוש נרחב גם עבור מגוון רחב של חומרים ביולוגיים 8,15; טיפולים אלה אכן מייצרים מידע פנוטיפי רב על ידי מתן תמונות באיכות גבוהה, אך גם דורשים שימוש בכימיקלים מסוכנים (למשל, פורמלדהיד, כלורל הידרט). מאמר זה מציג תחילה שיטת פנוטיפ קלה ונוחה יחסית, המפיקה תמונות המספיקות לניתוח כמותי, אך אינה דורשת שימוש בכימיקלים מסוכנים ובקליפות עלי אפידרמיס להכנת הדגימה. אפידרמיס cotyledon מוכתם TBO הוא גם אידיאלי לחקר התפתחות stomatal כי חוסר טריכומות ואת שיפוע התפתחותי קטן יותר cotyledons לאפשר פרשנות פשוטה ו tractable של פנוטיפים האפידרמיס.
פפטידים סטומאטליים EPF שייכים לקבוצה של פפטידים ספציפיים לצמחים, עשירים בציסטאין, בעלי גדלים בוגרים גדולים יחסית וקשרים דיסולפידים תוך-מולקולריים בין שאריות ציסטאין משומרות. קיפול קונפורמטיבי נכון הוא קריטי לתפקודם הביולוגי, אך פפטידים עשירים בציסטאין, המיוצרים על ידי סינתזה כימית או מערכת רקומבינציה הטרולוגית, יכולים להיות לא פעילים והם תערובת של פפטידים מקופלים כראוי ולא מקופלים 3,7,16. לפיכך, סינון של פפטידים ביו-אקטיביים שיש להם תפקיד בבקרת התפתחות סטומטית היה משימה מאתגרת מאוד. כתב יד זה מתאר בנוסף בדיקה ביולוגית לזיהוי ואפיון טוב יותר של פפטידים סטומאטליים ביו-אקטיביים. בשיטה זו, שתילי Arabidopsis גדלים בצלחת רב באר המכילה מדיה עם וללא פפטידים פוטנציאליים במשך 6-7 ימים. לאחר מכן, אפידרמיס cotyledon הוא דמיינו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. באופן כללי, כדי להמחיש בבירור את הפעילות הביולוגית של פפטידים פוטנציאליים בהתפתחות סטומטלית, הגנוטיפים המייצרים יותר ו / או פחות תאי שושלת סטומטלית, כגון מוטנט epf2, המייצר יותר תאי אפידרמיס, וקו STOMAGEN-ami, המקנה צפיפות תאי אפידרמיס מופחתת 2,4,5, משמשים בנוסף לבקרת Arabidopsis מסוג פראי (Col-0) עבור bioassays.
בסך הכל, שני הפרוטוקולים המוצגים כאן יכולים לשמש להערכה מהירה ויעילה של פנוטיפים אפידרמליים שונים ולסינון פפטידים קטנים והורמונים שיש להם תפקיד בבקרת דפוס סטומטלי והתפתחות.
Protocol
Representative Results
Discussion
שתי שיטות הניתוח הפנוטיפיות לזיהוי ואפיון הגנים השולטים בתבניות ובהתמיינות הסטומטית המוצגות כאן הן בדיקות נוחות ואמינות, שכן הפרוטוקולים אינם דורשים שימוש בקליפות אפידרמיס ובציוד ייעודי (הגוזלים זמן רב ודורשים הכשרה מיוחדת להכנת דגימות) אך כן מפיקים תמונות איכותיות לניתוח כמותי של פנו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן באמצעות תוכנית גילוי משאבי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC) ואוניברסיטת קונקורדיה. K.B. נתמך על ידי המלגה הלאומית בחו”ל מהודו.
Materials
| 18 mm x 18 mm cover slip | VWR | 16004-326 | |
| 24-well sterile plates with lid | VWR | CA62406-183 | |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
| 76 x 26 mm Microscope slide | TLG | GEW90-2575-03 | |
| Acetic acid, ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | |
| Bleech | Household bleach (e.g., Clorox) | ||
| Confocal microscope | Nikon | Nikon C2 operated by NIS-Elements | |
| Ethanol | Greenfield | P210EAAN | |
| FIJI | Open-srouce | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Gamborg's vitamin mixture | Cassson Labs | GBL01-100ML | Store at 4 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Growth chambers | Conviron, model E15 | 16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1. | |
| Lights | HD Supply | 25272 | Fluorescent lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 14-222-155 | Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera | |
| Murashige and Skoog basal salts | Cassson Labs | MSP01-1LT | Store at 4 °C |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
| Propidium Iodide | VWR | 39139-064 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.5 | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
References
- Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
- Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
- Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
- Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
- Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
- Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
- Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
- Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
- Nadeau, J. A., Sack, F. D. Control of stomatal distribution on the Arabidopsis leaf surface. Science. 296 (5573), 1697-1700 (2002).
- Meng, X., et al. Differential function of Arabidopsis SERK family receptor-like kinases in stomatal patterning. Current Biology. 25 (18), 2361-2372 (2015).
- Lampard, G. R., Macalister, C. A., Bergmann, D. C. Arabidopsis stomatal initiation is controlled by MAPK-mediated regulation of the bHLH SPEECHLESS. Science. 322 (5904), 1113-1116 (2008).
- Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. The Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
- Theunissen, J. D. An improved method for studying grass leaf epidermis. Stain Technology. 64 (5), 239-242 (1989).
- Venkata, B. P., et al. crw1–A novel maize mutant highly susceptible to foliar damage by the western corn rootworm beetle. PLoS One. 8 (8), 71296 (2013).
- Tucker, M. R., et al. Somatic small RNA pathways promote the mitotic events of megagametogenesis during female reproductive development in Arabidopsis. Development. 139 (8), 1399-1404 (2012).
- Ohki, S., Takeuchi, M., Mori, M. The NMR structure of stomagen reveals the basis of stomatal density regulation by plant peptide hormones. Nature Communications. 2, 512 (2011).
- Jangra, R., et al. Duplicated antagonistic EPF peptides optimize grass stomatal initiation. Development. 148 (16), (2021).
- Zhao, C., Craig, J. C., Petzold, H. E., Dickerman, A. W., Beers, E. P. The xylem and phloem transcriptomes from secondary tissues of the Arabidopsis root-hypocotyl. Plant Physiology. 138 (2), 803-818 (2005).
- Uchida, N., et al. Regulation of inflorescence architecture by intertissue layer ligand-receptor communication between endodermis and phloem. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (16), 6337-6342 (2012).
- Tameshige, T., et al. A secreted peptide and its receptors shape the auxin response pattern and leaf margin morphogenesis. Current Biology. 26 (18), 2478-2485 (2016).
- Abrash, E. B., Davies, K. A., Bergmann, D. C. Generation of signaling specificity in Arabidopsis by spatially restricted buffering of ligand-receptor interactions. The Plant Cell. 23 (8), 2864-2879 (2011).
- Uchida, N., Tasaka, M. Regulation of plant vascular stem cells by endodermis-derived EPFL-family peptide hormones and phloem-expressed ERECTA-family receptor kinases. Journal of Experimental Botany. 64 (17), 5335-5343 (2013).
- Kosentka, P. Z., Overholt, A., Maradiaga, R., Mitoubsi, O., Shpak, E. D. EPFL Signals in the boundary region of the SAM restrict its size and promote leaf initiation. Plant Physiology. 179 (1), 265-279 (2019).
