تحديد الجينات المشاركة في تطور الثغور عن طريق تسجيل النمط الظاهري للبشرة
Summary
تصف هذه الورقة طريقتين للتنميط الظاهري دون استخدام تقشير البشرة لتوصيف الجينات التي تتحكم في نمو الثغور. توضح الطريقة الأولى كيفية تحليل النمط الظاهري للثغور باستخدام بشرة نباتية زرقاء اللون بالتولويدين على شكل حرف O. تصف الطريقة الثانية كيفية التعرف على روابط الثغور ومراقبة أنشطتها البيولوجية.
Abstract
الثغور هي مسام صغيرة على سطح النباتات البرية تشارك في تبادل الغازات وإطلاق بخار الماء، ووظيفتها ضرورية لإنتاجية النبات وبقائه. وعلى هذا النحو، فإن فهم الآليات التي تتطور بها الثغور ونمطها له قيمة زراعية هائلة. يصف هذا البحث طريقتين للنمط الظاهري باستخدام ربتات Arabidopsis التي يمكن استخدامها لتوصيف الجينات التي تتحكم في تطور الثغور ونمطها. يتم تقديم الإجراءات أولا لتحليل الأنماط الظاهرية للثغور باستخدام النبتات الزرقاء الملطخة بالتولويدين O. هذه الطريقة سريعة وموثوقة ولا تتطلب استخدام تقشير البشرة ، والذي يستخدم على نطاق واسع لتحليلات النمط الظاهري ولكنه يتطلب تدريبا متخصصا. نظرا لوجود العديد من بقايا السيستين ، فإن تحديد وتوليد ببتيدات EPF النشطة بيولوجيا التي لها دور في نمو الثغور كان يمثل تحديا. وبالتالي ، فإن العرض الثاني هو إجراء يستخدم لتحديد روابط الثغور ومراقبة نشاطها البيولوجي عن طريق المقايسات الحيوية. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها تنتج بيانات قابلة للتكرار بسهولة نسبية مع تقليل كمية محلول الببتيد والوقت اللازم لتوصيف دور الببتيدات في التحكم في أنماط الثغور وتطورها. بشكل عام ، تعزز هذه البروتوكولات المصممة جيدا كفاءة دراسة منظمات الثغور المحتملة ، بما في ذلك الببتيدات الإفرازية الغنية بالسيستين ، والتي تتطلب هياكل معقدة للغاية لنشاطها.
Introduction
يعد التنميط والتمايز المناسبين للثغور النباتية أمرا بالغ الأهمية لوظيفتها في عمليتين بيولوجيتين أساسيتين ، التمثيل الضوئي والنتح ، ويتم فرضهما بواسطة مسارات إشارات الببتيد EPF. في أرابيدوبسيس، تتحكم ثلاثة ببتيدات غنية بالسيستين مفرزة، EPF1 و EPF2 و STOMAGEN/EPFL9، في جوانب مختلفة من تطور الثغور ويتم إدراكها بواسطة مكونات مستقبلات سطح الخلية، بما في ذلك كينازات مستقبلات عائلة ERECTA (ER و ERL1 و ERL2) و SERKsو TMM 1،2،3،4،5،6،7،8،9،10 . يؤدي هذا الاعتراف بعد ذلك إلى تقليل تنظيم عوامل النسخ التي تعزز تمايز الثغور من خلال عملية تعتمد على MAPK11. يتم اكتشاف جينات الثغور الأساسية هذه في المقام الأول من خلال الفحص الظاهري للمتحولات التي تظهر عيوب البشرة. تقدم هذه الورقة طرق التنميط الظاهري البسيطة والفعالة نسبيا لتصور الثغور وخلايا البشرة الأخرى ، وهي مطلوبة لتحديد وتوصيف الجينات المحتملة التي تتحكم في أنماط الثغور والتمايز.
عادة ما يتم تحقيق ملاحظة تفاصيل البشرة النباتية باستخدام تقشير البشرة مع أو بدون تلطيخ بصبغة مثل التولويدين الأزرق O (TBO) أو السافرانين12،13،14. ومع ذلك ، فإن التحدي الرئيسي لهذه الطرق هو أنها تتطلب تدريبا متخصصا لتقشير بشرة الأوراق دون تمزيق الأنسجة ومراقبة وتحليل بيانات الزخرفة بعناية مع تجنب الصور الملتقطة من أجزاء مختلفة من الورقة. كما تم استخدام المعالجات الكيميائية لإزالة عينات الأنسجة باستخدام الكواشف مثل محاليل المقاصة القائمة على هيدرات الكلورال على نطاق واسع لمجموعة مختلفة من المواد البيولوجية 8,15 ؛ تولد هذه العلاجات قدرا كبيرا من معلومات النمط الظاهري من خلال توفير صور عالية الجودة ولكنها تتطلب أيضا استخدام مواد كيميائية خطرة (مثل الفورمالديهايد وهيدرات الكلورال). تقدم هذه الورقة أولا طريقة سهلة ومريحة نسبيا للتنميط الظاهري تنتج صورا كافية للتحليل الكمي ولكنها لا تتطلب استخدام مواد كيميائية خطرة وقشور أوراق البشرة لإعداد العينة. تعتبر البشرة الملطخة ب TBO مثالية أيضا لدراسة تطور الثغور لأن نقص trichomes والتدرج التنموي الأصغر في الفلقات يسمح بالتفسير البسيط والقابل للتتبع للأنماط الظاهرية للبشرة.
تنتمي ببتيدات EPF الثغورية إلى مجموعة الببتيدات الغنية بالسيستين الخاصة بالنباتات والتي لها أحجام ناضجة كبيرة نسبيا وروابط ثاني كبريتيد داخل الجزيئات بين بقايا السيستين المحفوظة. يعد الطي المطابق الصحيح أمرا بالغ الأهمية لوظيفتها البيولوجية ، لكن الببتيدات الغنية بالسيستين ، والتي يتم إنتاجها إما عن طريق التخليق الكيميائي أو نظام إعادة التركيب غير المتجانس ، يمكن أن تكون غير نشطة وهي خليط من كل من الببتيدات المطوية وغير المطوية بشكل صحيح3،7،16. وبالتالي ، فإن فحص الببتيدات النشطة بيولوجيا التي لها دور في التحكم في نمو الثغور كان مهمة صعبة للغاية. تصف هذه المخطوطة بالإضافة إلى ذلك مقايسة حيوية لتحديد وتوصيف الببتيدات الثغورية النشطة بيولوجيا بشكل أفضل. في هذه الطريقة ، تزرع شتلات Arabidopsis في صفيحة متعددة الآبار تحتوي على وسائط مع وبدون ببتيدات محتملة لمدة 6-7 أيام. بعد ذلك ، يتم تصور بشرة النبتة باستخدام مجهر متحد البؤر. بشكل عام ، لتصور النشاط البيولوجي للببتيدات المحتملة بوضوح في تطور الثغور ، يتم استخدام الأنماط الجينية التي تنتج المزيد و / أو أقل من خلايا سلالة الثغور ، مثل متحولة epf2 ، التي تنتج المزيد من خلايا البشرة ، وخط STOMAGEN-ami ، الذي يمنح كثافة خلايا البشرة المنخفضة2،4،5 ، بالإضافة إلى مكافحة Arabidopsis من النوع البري (Col-0) للمقايسات الحيوية.
بشكل عام ، يمكن استخدام البروتوكولين المعروضين هنا للتقييم السريع والفعال للأنماط الظاهرية المختلفة للبشرة ولفحص الببتيدات الصغيرة والهرمونات التي لها دور في التحكم في أنماط الثغور وتطورها.
Protocol
Representative Results
Discussion
طريقتا تحليل النمط الظاهري لتحديد وتوصيف الجينات التي تتحكم في أنماط الثغور والتمايز المعروضة هنا هي مقايسات مريحة وموثوقة لأن البروتوكولات لا تتطلب استخدام تقشير البشرة والمعدات المتخصصة (التي تستغرق وقتا طويلا وتتطلب تدريبا خاصا لإعداد العينة) ولكنها تنتج صورا عالية الجودة للتحليل ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا البحث من خلال برنامج اكتشاف مجلس بحوث الموارد الطبيعية والهندسة في كندا (NSERC) وجامعة كونكورديا. يتم دعم KB من قبل المنحة الوطنية في الخارج من الهند.
Materials
| 18 mm x 18 mm cover slip | VWR | 16004-326 | |
| 24-well sterile plates with lid | VWR | CA62406-183 | |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
| 76 x 26 mm Microscope slide | TLG | GEW90-2575-03 | |
| Acetic acid, ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | |
| Bleech | Household bleach (e.g., Clorox) | ||
| Confocal microscope | Nikon | Nikon C2 operated by NIS-Elements | |
| Ethanol | Greenfield | P210EAAN | |
| FIJI | Open-srouce | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Gamborg's vitamin mixture | Cassson Labs | GBL01-100ML | Store at 4 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Growth chambers | Conviron, model E15 | 16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1. | |
| Lights | HD Supply | 25272 | Fluorescent lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 14-222-155 | Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera | |
| Murashige and Skoog basal salts | Cassson Labs | MSP01-1LT | Store at 4 °C |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
| Propidium Iodide | VWR | 39139-064 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.5 | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
References
- Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
- Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
- Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
- Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
- Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
- Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
- Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
- Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
- Nadeau, J. A., Sack, F. D. Control of stomatal distribution on the Arabidopsis leaf surface. Science. 296 (5573), 1697-1700 (2002).
- Meng, X., et al. Differential function of Arabidopsis SERK family receptor-like kinases in stomatal patterning. Current Biology. 25 (18), 2361-2372 (2015).
- Lampard, G. R., Macalister, C. A., Bergmann, D. C. Arabidopsis stomatal initiation is controlled by MAPK-mediated regulation of the bHLH SPEECHLESS. Science. 322 (5904), 1113-1116 (2008).
- Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. The Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
- Theunissen, J. D. An improved method for studying grass leaf epidermis. Stain Technology. 64 (5), 239-242 (1989).
- Venkata, B. P., et al. crw1–A novel maize mutant highly susceptible to foliar damage by the western corn rootworm beetle. PLoS One. 8 (8), 71296 (2013).
- Tucker, M. R., et al. Somatic small RNA pathways promote the mitotic events of megagametogenesis during female reproductive development in Arabidopsis. Development. 139 (8), 1399-1404 (2012).
- Ohki, S., Takeuchi, M., Mori, M. The NMR structure of stomagen reveals the basis of stomatal density regulation by plant peptide hormones. Nature Communications. 2, 512 (2011).
- Jangra, R., et al. Duplicated antagonistic EPF peptides optimize grass stomatal initiation. Development. 148 (16), (2021).
- Zhao, C., Craig, J. C., Petzold, H. E., Dickerman, A. W., Beers, E. P. The xylem and phloem transcriptomes from secondary tissues of the Arabidopsis root-hypocotyl. Plant Physiology. 138 (2), 803-818 (2005).
- Uchida, N., et al. Regulation of inflorescence architecture by intertissue layer ligand-receptor communication between endodermis and phloem. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (16), 6337-6342 (2012).
- Tameshige, T., et al. A secreted peptide and its receptors shape the auxin response pattern and leaf margin morphogenesis. Current Biology. 26 (18), 2478-2485 (2016).
- Abrash, E. B., Davies, K. A., Bergmann, D. C. Generation of signaling specificity in Arabidopsis by spatially restricted buffering of ligand-receptor interactions. The Plant Cell. 23 (8), 2864-2879 (2011).
- Uchida, N., Tasaka, M. Regulation of plant vascular stem cells by endodermis-derived EPFL-family peptide hormones and phloem-expressed ERECTA-family receptor kinases. Journal of Experimental Botany. 64 (17), 5335-5343 (2013).
- Kosentka, P. Z., Overholt, A., Maradiaga, R., Mitoubsi, O., Shpak, E. D. EPFL Signals in the boundary region of the SAM restrict its size and promote leaf initiation. Plant Physiology. 179 (1), 265-279 (2019).
