通过表皮表型评分 鉴定 参与气孔发育的基因
Summary
本文描述了两种不使用表皮剥皮的表型方法来表征控制气孔发育的基因。第一种方法演示了如何使用甲苯胺蓝O染色植物表皮分析气孔表型。第二种方法描述了如何识别气孔配体并监测其生物活性。
Abstract
气孔是陆地植物表面的小孔，参与气体交换和水蒸气释放，其功能对植物生产力和生存至关重要。因此，了解气孔发育和模式的机制具有巨大的农艺价值。本文描述了两种使用 拟南芥 子叶的表型方法，可用于表征控制气孔发育和模式化的基因。首先介绍使用甲苯胺蓝O染色子叶分析气孔表型的程序。该方法快速可靠，不需要使用表皮剥皮，表皮果皮广泛用于表型分析，但需要专门的培训。由于存在多个半胱氨酸残基，鉴定和生成在气孔发育中起作用的生物活性EPF肽一直具有挑战性。因此，第二呈现的是用于鉴定气孔配体并通过生物测定监测其生物活性的程序。该方法的主要优点是它相对容易地产生可重复的数据，同时减少了肽溶液的量和表征肽在控制气孔模式和发育中的作用所需的时间。总体而言，这些精心设计的方案提高了研究潜在气孔调节因子的效率，包括富含半胱氨酸的分泌肽，这些肽需要高度复杂的结构才能发挥其活性。
Introduction
植物气孔的正确图案化和分化对于它们在光合作用和蒸腾这两个基本生物过程中的功能至关重要，并且由EPF肽信号通路强制执行。在拟南芥中，三种分泌的富含半胱氨酸的肽 EPF1、EPF2 和气孔/EPFL9 控制气孔发育的不同方面，并被细胞表面受体成分感知，包括直立家族受体激酶（ER、ERL1 和 ERL2）、SERK 和 TMM1、2、3、4、5、6、7、8、9、10.然后，这种识别导致通过MAPK依赖性过程促进气孔分化的转录因子的下调11。这些核心气孔基因的发现主要是通过对表现出表皮缺陷的突变体进行表型筛选来实现的。本文提出了相对简单有效的表型方法，用于可视化气孔和其他表皮细胞，这是识别和表征控制气孔模式和分化的潜在基因所必需的。
植物表皮细节的观察通常是通过使用表皮果皮来实现的，有或没有用甲苯胺蓝O（TBO）或safranin12，13，14等染料染色。然而，这些方法的主要挑战是它们需要专门的培训来剥离叶子表皮而不撕裂组织，并仔细观察和分析图案数据，同时避免从叶子的不同部分拍摄的图像。使用水合氯醛基澄清溶液等试剂清除组织样品的化学处理也已广泛用于各种生物材料8，15;这些处理确实通过提供高质量的图像产生大量的表型信息，但也需要使用危险化学品（例如甲醛、水合氯醛）。本文首先提出了一种相对简单方便的表型分析方法，该方法产生的图像足以进行定量分析，但不需要使用危险化学品和表皮叶皮进行样品制备。TBO染色的子叶表皮也是研究气孔发育的理想选择，因为子叶中缺乏毛状体和较小的发育梯度允许对表皮表型进行简单易处理的解释。
气孔EPF肽属于植物特异性，富含半胱氨酸的肽组，具有相对较大的成熟尺寸和保守半胱氨酸残基之间的分子内二硫键。正确的构象折叠对其生物学功能至关重要，但通过化学合成或异源重组系统产生的富含半胱氨酸的肽可能是无活性的，并且是正确折叠和未折叠肽的混合物3，7，16。因此，筛选在控制气孔发育方面起作用的生物活性肽是一项非常具有挑战性的任务。本手稿还描述了一种生物测定方法，用于更好地鉴定和表征生物活性气孔肽。在该方法中，拟南芥幼苗在含有和没有潜在肽的培养基的多孔板中生长6-7天。然后，使用共聚焦显微镜观察子叶表皮。一般来说，为了清楚地看到气孔发育中潜在肽的生物活性，除了用于生物测定的野生型拟南芥对照 （Col-0） 外，还使用了产生更多和/或更少气孔谱系细胞的基因型，例如产生更多表皮细胞的 epf2 突变体和赋予降低表皮细胞密度2，4，5 的 stomagen-ami 系。
总体而言，此处介绍的两个方案可用于快速有效地评估各种表皮表型，并用于筛选在控制气孔模式和发育方面起作用的小肽和激素。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里介绍的用于鉴定和表征控制气孔模式和分化的基因的两种表型分析方法是方便可靠的测定，因为该方案不需要使用表皮剥离和专用设备（这很耗时并且需要特殊的样品制备培训），但确实可以产生高质量的图像用于表皮表型的定量分析。
该技术使用TBO染色拟 南芥 子叶进行表型分析的局限性在于，获得不同表皮细胞类型的具有视觉对比度的高质量图像取决于染色时…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究由加拿大自然资源和工程研究委员会（NSERC）发现计划和康考迪亚大学资助。K.B.得到了印度国家海外奖学金的支持。
Materials
| 18 mm x 18 mm cover slip | VWR | 16004-326 | |
| 24-well sterile plates with lid | VWR | CA62406-183 | |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
| 76 x 26 mm Microscope slide | TLG | GEW90-2575-03 | |
| Acetic acid, ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | |
| Bleech | Household bleach (e.g., Clorox) | ||
| Confocal microscope | Nikon | Nikon C2 operated by NIS-Elements | |
| Ethanol | Greenfield | P210EAAN | |
| FIJI | Open-srouce | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Gamborg's vitamin mixture | Cassson Labs | GBL01-100ML | Store at 4 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Growth chambers | Conviron, model E15 | 16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1. | |
| Lights | HD Supply | 25272 | Fluorescent lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 14-222-155 | Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera | |
| Murashige and Skoog basal salts | Cassson Labs | MSP01-1LT | Store at 4 °C |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
| Propidium Iodide | VWR | 39139-064 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.5 | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
References
- Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
- Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
- Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
- Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
- Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
- Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
- Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
- Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
- Nadeau, J. A., Sack, F. D. Control of stomatal distribution on the Arabidopsis leaf surface. Science. 296 (5573), 1697-1700 (2002).
- Meng, X., et al. Differential function of Arabidopsis SERK family receptor-like kinases in stomatal patterning. Current Biology. 25 (18), 2361-2372 (2015).
- Lampard, G. R., Macalister, C. A., Bergmann, D. C. Arabidopsis stomatal initiation is controlled by MAPK-mediated regulation of the bHLH SPEECHLESS. Science. 322 (5904), 1113-1116 (2008).
- Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. The Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
- Theunissen, J. D. An improved method for studying grass leaf epidermis. Stain Technology. 64 (5), 239-242 (1989).
- Venkata, B. P., et al. crw1–A novel maize mutant highly susceptible to foliar damage by the western corn rootworm beetle. PLoS One. 8 (8), 71296 (2013).
- Tucker, M. R., et al. Somatic small RNA pathways promote the mitotic events of megagametogenesis during female reproductive development in Arabidopsis. Development. 139 (8), 1399-1404 (2012).
- Ohki, S., Takeuchi, M., Mori, M. The NMR structure of stomagen reveals the basis of stomatal density regulation by plant peptide hormones. Nature Communications. 2, 512 (2011).
- Jangra, R., et al. Duplicated antagonistic EPF peptides optimize grass stomatal initiation. Development. 148 (16), (2021).
- Zhao, C., Craig, J. C., Petzold, H. E., Dickerman, A. W., Beers, E. P. The xylem and phloem transcriptomes from secondary tissues of the Arabidopsis root-hypocotyl. Plant Physiology. 138 (2), 803-818 (2005).
- Uchida, N., et al. Regulation of inflorescence architecture by intertissue layer ligand-receptor communication between endodermis and phloem. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (16), 6337-6342 (2012).
- Tameshige, T., et al. A secreted peptide and its receptors shape the auxin response pattern and leaf margin morphogenesis. Current Biology. 26 (18), 2478-2485 (2016).
- Abrash, E. B., Davies, K. A., Bergmann, D. C. Generation of signaling specificity in Arabidopsis by spatially restricted buffering of ligand-receptor interactions. The Plant Cell. 23 (8), 2864-2879 (2011).
- Uchida, N., Tasaka, M. Regulation of plant vascular stem cells by endodermis-derived EPFL-family peptide hormones and phloem-expressed ERECTA-family receptor kinases. Journal of Experimental Botany. 64 (17), 5335-5343 (2013).
- Kosentka, P. Z., Overholt, A., Maradiaga, R., Mitoubsi, O., Shpak, E. D. EPFL Signals in the boundary region of the SAM restrict its size and promote leaf initiation. Plant Physiology. 179 (1), 265-279 (2019).
