Identificatie van de genen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van stomato via epidermale fenotypescores
Summary
Dit artikel beschrijft twee fenotyperingsmethoden zonder het gebruik van epidermale peelings om de genen te karakteriseren die de stomatale ontwikkeling regelen. De eerste methode demonstreert hoe een stomataal fenotype kan worden geanalyseerd met behulp van een toluidineblauwe O-gekleurde plantenepidermis. De tweede methode beschrijft hoe stomatale liganden te identificeren en hun biologische activiteiten te volgen.
Abstract
Huidmondjes zijn kleine poriën op het oppervlak van landplanten die betrokken zijn bij gasuitwisseling en waterdampafgifte, en hun functie is van cruciaal belang voor de productiviteit en overleving van planten. Als zodanig heeft het begrijpen van de mechanismen waarmee huidmondjes zich ontwikkelen en patroon een enorme agronomische waarde. Dit artikel beschrijft twee fenotypische methoden met behulp van Arabidopsis zaadlobben die kunnen worden gebruikt om de genen te karakteriseren die de stomatale ontwikkeling en patronen regelen. Eerst worden procedures gepresenteerd voor het analyseren van de stomatale fenotypes met behulp van toluidineblauwe O-gekleurde zaadlobben. Deze methode is snel en betrouwbaar en vereist geen gebruik van epidermale peelings, die veel worden gebruikt voor fenotypische analyses, maar gespecialiseerde training vereisen. Vanwege de aanwezigheid van meerdere cysteïneresiduen is de identificatie en generatie van bioactieve EPF-peptiden die een rol spelen bij de stomatale ontwikkeling een uitdaging geweest. De tweede wordt dus een procedure gepresenteerd die wordt gebruikt om stomatale liganden te identificeren en hun biologische activiteit te controleren door middel van bioassays. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het relatief gemakkelijk reproduceerbare gegevens produceert, terwijl de hoeveelheid peptide-oplossing en de tijd die nodig is om de rol van de peptiden bij het beheersen van stomatale patronen en ontwikkeling te karakteriseren, worden verminderd. Over het algemeen verbeteren deze goed ontworpen protocollen de efficiëntie van het bestuderen van de potentiële stomatale regulatoren, waaronder cysteïnerijke secretoire peptiden, die zeer complexe structuren vereisen voor hun activiteit.
Introduction
Een goede patroonvorming en differentiatie van de plantenhuidmondjes zijn van cruciaal belang voor hun functie in twee fundamentele biologische processen, fotosynthese en transpiratie, en worden afgedwongen door EPF-peptidesignaleringsroutes. In Arabidopsis controleren drie uitgescheiden cysteïnerijke peptiden, EPF1, EPF2 en STOMAGEEN / EPFL9, verschillende aspecten van stomatale ontwikkeling en worden waargenomen door celoppervlakreceptorcomponenten, waaronder ERECTA-familie receptorkinasen (ER, ERL1 en ERL2), SERKs en TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Deze herkenning leidt vervolgens tot de downregulatie van de transcriptiefactoren die stomatale differentiatie bevorderen door een MAPK-afhankelijk proces11. De ontdekking van deze kernstomatale genen wordt voornamelijk bereikt door de fenotypische screening van mutanten die epidermale defecten vertonen. Dit artikel presenteert relatief eenvoudige en efficiënte fenotyperingsmethoden voor het visualiseren van de huidmondjes en andere epidermale cellen, die nodig zijn om de potentiële genen te identificeren en te karakteriseren die stomatale patronen en differentiatie regelen.
De observatie van de details van de epidermis van de plant is meestal bereikt door epidermale peelings te gebruiken met of zonder kleuring met een kleurstof zoals toluidineblauw O (TBO) of safranine12,13,14. De grootste uitdaging van deze methoden is echter dat ze gespecialiseerde training vereisen om de bladepidermis te pellen zonder de weefsels te scheuren en om de patroongegevens zorgvuldig te observeren en te analyseren terwijl de afbeeldingen uit verschillende delen van het blad worden vermeden. Chemische behandelingen om de weefselmonsters te zuiveren met reagentia zoals op chloraalhydraat gebaseerde reinigingsoplossingen zijn ook op grote schaal gebruikt voor een verschillende reeks biologische materialen 8,15; Deze behandelingen genereren veel fenotypische informatie door beelden van hoge kwaliteit te leveren, maar vereisen ook het gebruik van gevaarlijke chemicaliën (bijv. Formaldehyde, chloraalhydraat). Dit artikel presenteert eerst een relatief eenvoudige en handige fenotyperingsmethode die beelden produceert die voldoende zijn voor kwantitatieve analyse, maar waarvoor geen gevaarlijke chemicaliën en epidermale bladschillen nodig zijn voor de monstervoorbereiding. Een TBO-gekleurde zaadlobben epidermis is ook ideaal voor de studie van stomatale ontwikkeling omdat het ontbreken van trichomen en de kleinere ontwikkelingsgradiënt in zaadlobben de eenvoudige en handelbare interpretatie van de epidermale fenotypen mogelijk maken.
Stomatale EPF-peptiden behoren tot de groep van plantspecifieke, cysteïnerijke peptiden met relatief grote volwassen afmetingen en intramoleculaire disulfidebindingen tussen geconserveerde cysteïneresiduen. Correcte conformatievouwing is van cruciaal belang voor hun biologische functie, maar cysteïnerijke peptiden, die worden geproduceerd door chemische synthese of een heterologe recombinatiesysteem, kunnen inactief zijn en zijn een mengsel van zowel correct gevouwen als ongevouwen peptiden 3,7,16. De screening van bioactieve peptiden die een rol spelen bij het beheersen van de stomatale ontwikkeling is dus een zeer uitdagende taak geweest. Dit manuscript beschrijft bovendien een bioassay voor de betere identificatie en karakterisering van bioactieve stomatale peptiden. Bij deze methode worden Arabidopsis-zaailingen gedurende 6-7 dagen gekweekt in een multi-well plaat met media met en zonder potentiële peptiden. Vervolgens wordt de zaadlobben epidermis gevisualiseerd met behulp van een confocale microscoop. In het algemeen, om de biologische activiteit van potentiële peptiden in de stomatale ontwikkeling duidelijk te visualiseren, worden de genotypen die meer en / of minder stomatale afstammingscellen produceren, zoals de epf2-mutant, die meer epidermale cellen produceert, en de STOMAGEN-ami-lijn, die een verminderde epidermale celdichtheid 2,4,5 verleent, gebruikt naast de wild-type Arabidopsis-controle (Col-0) voor de bioassays.
Over het algemeen kunnen de twee hier gepresenteerde protocollen worden gebruikt voor de snelle en efficiënte beoordeling van verschillende epidermale fenotypen en voor het screenen van kleine peptiden en hormonen die een rol spelen bij het beheersen van stomatale patronen en ontwikkeling.
Protocol
Representative Results
Discussion
De twee fenotypische analysemethoden voor het identificeren en karakteriseren van de genen die stomatale patronen en differentiatie regelen, die hier worden gepresenteerd, zijn handige en betrouwbare testen, omdat de protocollen geen epidermale peelings en gespecialiseerde apparatuur vereisen (die tijdrovend zijn en speciale training vereisen voor monstervoorbereiding), maar wel beelden van hoge kwaliteit produceren voor de kwantitatieve analyse van epidermale fenotypen.
Een beperking van deze…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gefinancierd door het Natural Resources and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery-programma en Concordia University. K.B. wordt ondersteund door de National Overseas Scholarship uit India.
Materials
| 18 mm x 18 mm cover slip | VWR | 16004-326 | |
| 24-well sterile plates with lid | VWR | CA62406-183 | |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
| 76 x 26 mm Microscope slide | TLG | GEW90-2575-03 | |
| Acetic acid, ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | |
| Bleech | Household bleach (e.g., Clorox) | ||
| Confocal microscope | Nikon | Nikon C2 operated by NIS-Elements | |
| Ethanol | Greenfield | P210EAAN | |
| FIJI | Open-srouce | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Gamborg's vitamin mixture | Cassson Labs | GBL01-100ML | Store at 4 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Growth chambers | Conviron, model E15 | 16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1. | |
| Lights | HD Supply | 25272 | Fluorescent lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 14-222-155 | Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera | |
| Murashige and Skoog basal salts | Cassson Labs | MSP01-1LT | Store at 4 °C |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
| Propidium Iodide | VWR | 39139-064 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.5 | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
References
- Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
- Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
- Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
- Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
- Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
- Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
- Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
- Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
- Nadeau, J. A., Sack, F. D. Control of stomatal distribution on the Arabidopsis leaf surface. Science. 296 (5573), 1697-1700 (2002).
- Meng, X., et al. Differential function of Arabidopsis SERK family receptor-like kinases in stomatal patterning. Current Biology. 25 (18), 2361-2372 (2015).
- Lampard, G. R., Macalister, C. A., Bergmann, D. C. Arabidopsis stomatal initiation is controlled by MAPK-mediated regulation of the bHLH SPEECHLESS. Science. 322 (5904), 1113-1116 (2008).
- Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. The Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
- Theunissen, J. D. An improved method for studying grass leaf epidermis. Stain Technology. 64 (5), 239-242 (1989).
- Venkata, B. P., et al. crw1–A novel maize mutant highly susceptible to foliar damage by the western corn rootworm beetle. PLoS One. 8 (8), 71296 (2013).
- Tucker, M. R., et al. Somatic small RNA pathways promote the mitotic events of megagametogenesis during female reproductive development in Arabidopsis. Development. 139 (8), 1399-1404 (2012).
- Ohki, S., Takeuchi, M., Mori, M. The NMR structure of stomagen reveals the basis of stomatal density regulation by plant peptide hormones. Nature Communications. 2, 512 (2011).
- Jangra, R., et al. Duplicated antagonistic EPF peptides optimize grass stomatal initiation. Development. 148 (16), (2021).
- Zhao, C., Craig, J. C., Petzold, H. E., Dickerman, A. W., Beers, E. P. The xylem and phloem transcriptomes from secondary tissues of the Arabidopsis root-hypocotyl. Plant Physiology. 138 (2), 803-818 (2005).
- Uchida, N., et al. Regulation of inflorescence architecture by intertissue layer ligand-receptor communication between endodermis and phloem. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (16), 6337-6342 (2012).
- Tameshige, T., et al. A secreted peptide and its receptors shape the auxin response pattern and leaf margin morphogenesis. Current Biology. 26 (18), 2478-2485 (2016).
- Abrash, E. B., Davies, K. A., Bergmann, D. C. Generation of signaling specificity in Arabidopsis by spatially restricted buffering of ligand-receptor interactions. The Plant Cell. 23 (8), 2864-2879 (2011).
- Uchida, N., Tasaka, M. Regulation of plant vascular stem cells by endodermis-derived EPFL-family peptide hormones and phloem-expressed ERECTA-family receptor kinases. Journal of Experimental Botany. 64 (17), 5335-5343 (2013).
- Kosentka, P. Z., Overholt, A., Maradiaga, R., Mitoubsi, O., Shpak, E. D. EPFL Signals in the boundary region of the SAM restrict its size and promote leaf initiation. Plant Physiology. 179 (1), 265-279 (2019).
