Identifisering av gener involvert i stomatal utvikling via epidermal fenotypeskåring

Summary

Denne artikkelen beskriver to fenotypingsmetoder uten bruk av epidermal peeling for å karakterisere genene som styrer stomatal utvikling. Den første metoden demonstrerer hvordan man analyserer en stomatal fenotype ved hjelp av en toluidinblå O-farget planteepidermis. Den andre metoden beskriver hvordan man identifiserer stomatale ligander og overvåker deres biologiske aktiviteter.

Abstract

Stomata er små porer på overflaten av landplanter som er involvert i gassutveksling og vanndamputslipp, og deres funksjon er kritisk for planteproduktivitet og overlevelse. Som sådan har forståelse av mekanismene som stomata utvikler seg og mønster enorm agronomisk verdi. Denne artikkelen beskriver to fenotypiske metoder ved bruk av Arabidopsis cotyledoner som kan brukes til å karakterisere genene som styrer stomatal utvikling og mønster. Presentert først er prosedyrer for analyse av stomatale fenotyper ved bruk av toluidinblå O-fargede cotyledoner. Denne metoden er rask og pålitelig og krever ikke bruk av epidermale peeling, som er mye brukt for fenotypiske analyser, men krever spesialisert opplæring. På grunn av tilstedeværelsen av flere cysteinrester har identifisering og generering av bioaktive EPF-peptider som har en rolle i stomatal utvikling vært utfordrende. Dermed presenteres andre er en prosedyre som brukes til å identifisere stomatale ligander og overvåke deres biologiske aktivitet ved bioassay. Den største fordelen med denne metoden er at den produserer reproduserbare data relativt enkelt, samtidig som mengden peptidløsning reduseres og tiden som kreves for å karakterisere peptidenes rolle i å kontrollere stomatal mønster og utvikling. Samlet sett forbedrer disse veldesignede protokollene effektiviteten ved å studere potensielle stomatale regulatorer, inkludert cysteinrike sekretoriske peptider, som krever svært komplekse strukturer for deres aktivitet.

Introduction

Riktig mønster og differensiering av plantestomata er avgjørende for deres funksjon i to grunnleggende biologiske prosesser, fotosyntese og transpirasjon, og håndheves av EPF-peptidsignalveier. I Arabidopsis kontrollerer tre utskilte cysteinrike peptider, EPF1, EPF2 og STOMAGEN / EPFL9, forskjellige aspekter av stomatal utvikling og oppfattes av celleoverflatereseptorkomponenter, inkludert ERECTA-familie reseptorkinaser (ER, ERL1 og ERL2), SERKs og TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Denne erkjennelsen fører deretter til nedregulering av transkripsjonsfaktorene som fremmer stomatal differensiering ved en MAPK-avhengig prosess¹¹. Oppdagelsen av disse kjernestomatale genene oppnås først og fremst ved fenotypisk screening av mutanter som viser epidermale defekter. Denne artikkelen presenterer relativt enkle og effektive fenotypingsmetoder for å visualisere stomata og andre epidermale celler, som kreves for å identifisere og karakterisere potensielle gener som styrer stomatal mønster og differensiering.

Observasjonen av detaljene i planteepidermis har vanligvis blitt oppnådd ved å bruke epidermale peelinger med eller uten farging med et fargestoff som toluidinblå O (TBO) eller safranin^12,13,14. Hovedutfordringen med disse metodene er imidlertid at de krever spesialisert trening for å skrelle bladepidermis uten å rive vevet og nøye observere og analysere mønsterdataene samtidig som man unngår bildene tatt fra forskjellige deler av bladet. Kjemiske behandlinger for å fjerne vevsprøvene med reagenser som kloralhydratbaserte clearingløsninger har også blitt mye brukt for et annet utvalg av biologiske materialer ^8,15; Disse behandlingene genererer mye fenotypisk informasjon ved å gi bilder av høy kvalitet, men krever også bruk av farlige kjemikalier (f.eks. Formaldehyd, kloralhydrat). Denne artikkelen presenterer først en relativt enkel og praktisk fenotypingsmetode som produserer bilder som er tilstrekkelige for kvantitativ analyse, men krever ikke bruk av farlige kjemikalier og epidermale bladpeelinger for prøveprepareringen. En TBO-farget cotyledon epidermis er også ideell for studiet av stomatal utvikling fordi mangelen på trikomer og den mindre utviklingsgradienten i cotyledoner tillater enkel og traktabel tolkning av epidermale fenotyper.

Stomatale EPF-peptider tilhører gruppen av plantespesifikke, cysteinrike peptider som har relativt store modne størrelser og intramolekylære disulfidbindinger mellom konserverte cysteinrester. Korrekt konformasjonsfolding er kritisk for deres biologiske funksjon, men cysteinrike peptider, som produseres ved enten kjemisk syntese eller et heterologt rekombinasjonssystem, kan være inaktive og er en blanding av både riktig foldede og utfoldede peptider ^3,7,16. Dermed har screening av bioaktive peptider som har en rolle i å kontrollere stomatal utvikling vært en svært utfordrende oppgave. Dette manuskriptet beskriver i tillegg et bioassay for bedre identifisering og karakterisering av bioaktive stomatale peptider. I denne metoden dyrkes Arabidopsis-frøplanter i en flerbrønnsplate som inneholder medier med og uten potensielle peptider i 6-7 dager. Deretter visualiseres cotyledon epidermis ved hjelp av et konfokalmikroskop. Generelt, for å tydelig visualisere den biologiske aktiviteten til potensielle peptider i stomatal utvikling, brukes genotypene som produserer flere og / eller mindre stomatale avstamningsceller, som epf2-mutanten, som produserer flere epidermale celler, og STOMAGEN-ami-linjen, som gir redusert epidermal celletetthet ^2,4,5, i tillegg til villtype Arabidopsis-kontrollen (Col-0) for bioassayene.

Samlet sett kan de to protokollene som presenteres her brukes til rask og effektiv vurdering av ulike epidermale fenotyper og for screening av små peptider og hormoner som har en rolle i å kontrollere stomatal mønster og utvikling.

Protocol

1. Farging av Arabidopsis cotyledoner med TBO Frøsterilisering og vekstforholdSteriliser ~30 Arabidopsisfrø per genotype i et mikrosentrifugerør ved å tilsette 1 ml av en frøsteriliseringsløsning (33% kommersielt blekemiddel, 0,1% Triton X-100), og gyng forsiktig i 10-12 minutter ved romtemperatur (RT).MERK: Steriliser ~ 30 frø av villtype Arabidopsis tiltredelse Columbia (Col-0) og / eller ~ 60 frø av transgene planter som bærer et kjemisk induse…

Representative Results

Ulike stomatale transgene planter og mutanter kjent for å ha mindre eller mer stomatal tetthet og klynger (epf2 2,5, epf1 epf2 2,5, tmm12, en STOMAGEN-lydløs linje4, og transgene linjer som bærer den østradiolinduserbare Est::EPF1 eller Est::EPF2 overuttrykkskonstruksjon7 ) bl…

Discussion

De to fenotypiske analysemetodene for å identifisere og karakterisere genene som kontrollerer stomatal mønster og differensiering presentert her, er praktiske og pålitelige analyser siden protokollene ikke krever bruk av epidermale peelinger og spesialutstyr (som er tidkrevende og krever spesiell trening for prøvepreparering), men produserer bilder av høy kvalitet for kvantitativ analyse av epidermale fenotyper.

En begrensning ved denne teknikken for fenotypisk analyse ved bruk av TBO-far…

Materials

18 mm x 18 mm cover slip	VWR	16004-326
24-well sterile plates with lid	VWR	CA62406-183
3M Micropore surgical tape	Fisher Scientific	19-027-761	Microporous surgical paper tape used to seal MS plates
76 x 26 mm Microscope slide	TLG	GEW90-2575-03
Acetic acid, ≥99.8%	Fisher Scientific	A38-212
Agar	BioShop	AGR001.1
Bleech	Household bleach (e.g., Clorox)
Confocal microscope	Nikon		Nikon C2 operated by NIS-Elements
Ethanol	Greenfield	P210EAAN
FIJI	Open-srouce	(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j	Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/
Forceps	Sigma-Aldrich	F6521
Gamborg's vitamin mixture	Cassson Labs	GBL01-100ML	Store at 4 °C
Glycerol	Fisher Scientific	G33-4
Growth chambers	Conviron, model E15		16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1.
Lights	HD Supply	25272	Fluorescent  lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K
Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	14-222-155	Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization
Microscope	Nikon		Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera
Murashige and Skoog basal salts	Cassson Labs	MSP01-1LT	Store at 4 °C
Petri Dish 100 mm x 20 mm	Fisher Scientific	08-757-11Z	Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana
Propidium Iodide	VWR	39139-064
Scalpel	Fisher Scientific	08-916-5A
Sucrose	BioShop	SUC700.5
Toluidine blue O	Sigma-Aldrich	T3260-5G
Tris base	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-100ML
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758