Identificação dos genes envolvidos no desenvolvimento estomático via Epidermal Phenotype Scoring
Summary
Este trabalho descreve dois métodos de fenotipagem sem o uso de cascas epidérmicas para caracterizar os genes que controlam o desenvolvimento estomatizante. O primeiro método demonstra como analisar um fenótipo estomatal usando uma epiderme vegetal corada com O azul de toluidina . O segundo método descreve como identificar ligantes estomatáticos e monitorar suas atividades biológicas.
Abstract
Os estomatos são pequenos poros na superfície das plantas terrestres que estão envolvidos na troca gasosa e na liberação de vapor de água, e sua função é crítica para a produtividade e sobrevivência das plantas. Como tal, a compreensão dos mecanismos pelos quais os estômatos se desenvolvem e padronizam tem um tremendo valor agronômico. Este trabalho descreve dois métodos fenotípicos utilizando Arabidopsis cotyledons que podem ser usados para caracterizar os genes que controlam o desenvolvimento estomático e a padronização. Primeiramente são apresentados os procedimentos para análise dos fenótipos estomatáticos utilizando cotilédones corados com azul de toluidina O. Este método é rápido e confiável e não requer o uso de peelings epidérmicos, que são amplamente utilizados para análises fenotípicas, mas exigem treinamento especializado. Devido à presença de múltiplos resíduos de cisteína, a identificação e geração de peptídeos EPF bioativos que têm um papel no desenvolvimento estomático têm sido desafiadores. Assim, apresenta-se em segundo lugar um procedimento utilizado para identificar ligantes estomatáticos e monitorar sua atividade biológica por bioensaios. A principal vantagem deste método é que ele produz dados reprodutíveis com relativa facilidade, reduzindo a quantidade de solução peptídica e o tempo necessário para caracterizar o papel dos peptídeos no controle do padrão estomático e desenvolvimento. No geral, esses protocolos bem projetados aumentam a eficiência do estudo dos potenciais reguladores estomáticos, incluindo peptídeos secretores ricos em cisteína, que exigem estruturas altamente complexas para sua atividade.
Introduction
A padronização adequada e a diferenciação dos estômatos vegetais são críticas para sua função em dois processos biológicos fundamentais, fotossíntese e transpiração, e são impostas pelas vias de sinalização do peptídeo EPF. Na Arabidopsis, três peptídeos ricos em cisteína secretados, EPF1, EPF2 e STOMAGEN/EPFL9, controlam diferentes aspectos do desenvolvimento estomático e são percebidos pelos componentes do receptor da superfície celular, incluindo quinases receptoras da família ERECTA (ER, ERL1 e ERL2), SERKs e TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Esse reconhecimento, então, leva à regulação negativa dos fatores de transcrição que promovem a diferenciação estomática por um processo dependente de MAPK11. A descoberta desses genes estomatâmicos centrais é alcançada principalmente pela triagem fenotípica de mutantes que exibem defeitos epidérmicos. Este trabalho apresenta métodos de fenotipagem relativamente simples e eficientes para a visualização dos estômatos e outras células epidérmicas, que são necessários para identificar e caracterizar os genes potenciais que controlam a padronização e diferenciação estomática.
A observação dos detalhes da epiderme vegetal tem sido tipicamente realizada por meio de peelings epidérmicos com ou sem coloração com corante como azul de toluidina O (TBO) ou safranina12,13,14. No entanto, o principal desafio desses métodos é que eles exigem treinamento especializado para descascar a epiderme foliar sem rasgar os tecidos e observar e analisar cuidadosamente os dados de padronização, evitando as imagens retiradas de diferentes partes da folha. Tratamentos químicos para limpar as amostras de tecido com reagentes, como soluções de clareamento à base de hidrato de cloral, também têm sido amplamente utilizados para uma variedade de materiais biológicos 8,15; esses tratamentos geram uma grande quantidade de informações fenotípicas, fornecendo imagens de alta qualidade, mas também exigem o uso de produtos químicos perigosos (por exemplo, formaldeído, hidrato de cloral). Este artigo apresenta primeiro um método de fenotipagem relativamente fácil e conveniente que produz imagens suficientes para análise quantitativa, mas não requer o uso de produtos químicos perigosos e cascas de folhas epidérmicas para a preparação da amostra. Uma epiderme de cotilédones corada com TBO também é ideal para o estudo do desenvolvimento estomático, pois a falta de tricomas e o menor gradiente de desenvolvimento nos cotilédones permitem a interpretação simples e tratável dos fenótipos epidérmicos.
Os peptídeos estomáticos EPF pertencem ao grupo de peptídeos específicos de plantas, ricos em cisteína, que têm tamanhos maduros relativamente grandes e ligações dissulfeto intramoleculares entre resíduos de cisteína conservados. O correto dobramento conformacional é fundamental para sua função biológica, mas os peptídeos ricos em cisteína, que são produzidos por síntese química ou por um sistema de recombinação heteróloga, podem ser inativos e são uma mistura de peptídeos adequadamente dobrados e desdobrados 3,7,16. Assim, o rastreamento de peptídeos bioativos que têm um papel no controle do desenvolvimento estomático tem sido uma tarefa muito desafiadora. Este manuscrito descreve adicionalmente um bioensaio para a melhor identificação e caracterização de peptídeos estomáticos bioativos. Neste método, as mudas de Arabidopsis são cultivadas em uma placa de múltiplos poços contendo meios com e sem peptídeos potenciais por 6-7 dias. Em seguida, a epiderme do cotilédones é visualizada usando um microscópio confocal. Em geral, para visualizar claramente a atividade biológica de peptídeos potenciais no desenvolvimento estomático, os genótipos que produzem mais e/ou menos células estomáticas da linhagem, como o mutante epf2, que produz mais células epidérmicas, e a linhagem STOMAGEN-ami, que confere densidade celular epidérmica reduzida 2,4,5, são utilizados além do controle de Arabidopsis do tipo selvagem (Col-0) para os bioensaios.
No geral, os dois protocolos aqui apresentados podem ser utilizados para a avaliação rápida e eficiente de vários fenótipos epidérmicos e para o rastreamento de pequenos peptídeos e hormônios que têm um papel no controle do padrão estomático e do desenvolvimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os dois métodos de análise fenotípica para identificar e caracterizar os genes que controlam a padronização e diferenciação estomática aqui apresentados são ensaios convenientes e confiáveis, uma vez que os protocolos não exigem o uso de peelings epidérmicos e equipamentos especializados (que são demorados e requerem treinamento especial para o preparo da amostra), mas produzem imagens de alta qualidade para a análise quantitativa dos fenótipos epidérmicos.
Uma limitação dess…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi financiada através do programa de Descoberta do Conselho de Pesquisa de Recursos Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC) e da Universidade de Concordia. K.B. é apoiado pela National Overseas Scholarship da Índia.
Materials
| 18 mm x 18 mm cover slip | VWR | 16004-326 | |
| 24-well sterile plates with lid | VWR | CA62406-183 | |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
| 76 x 26 mm Microscope slide | TLG | GEW90-2575-03 | |
| Acetic acid, ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | |
| Bleech | Household bleach (e.g., Clorox) | ||
| Confocal microscope | Nikon | Nikon C2 operated by NIS-Elements | |
| Ethanol | Greenfield | P210EAAN | |
| FIJI | Open-srouce | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Gamborg's vitamin mixture | Cassson Labs | GBL01-100ML | Store at 4 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Growth chambers | Conviron, model E15 | 16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1. | |
| Lights | HD Supply | 25272 | Fluorescent lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 14-222-155 | Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera | |
| Murashige and Skoog basal salts | Cassson Labs | MSP01-1LT | Store at 4 °C |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
| Propidium Iodide | VWR | 39139-064 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.5 | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
References
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