Идентификация генов, участвующих в развитии устьиц, с помощью оценки эпидермального фенотипа
Summary
В данной работе описаны два метода фенотипирования без использования эпидермального пилинга для характеристики генов, контролирующих развитие устьиц. Первый метод демонстрирует, как анализировать фенотип устьиц с использованием эпидермиса растений, окрашенного толуидиновым синим О. Второй метод описывает, как идентифицировать устьичные лиганды и контролировать их биологическую активность.
Abstract
Устьица — это небольшие поры на поверхности наземных растений, которые участвуют в газообмене и выделении водяного пара, и их функция имеет решающее значение для продуктивности и выживания растений. Таким образом, понимание механизмов, с помощью которых развиваются устьица, имеет огромное агрономическое значение. В этой статье описываются два фенотипических метода с использованием семядолей Arabidopsis , которые могут быть использованы для характеристики генов, контролирующих развитие устьиц и формирование паттернов. Сначала представлены процедуры анализа фенотипов устьиц с использованием толуидиновых О-окрашенных семядолей. Этот метод является быстрым и надежным и не требует использования эпидермальных пилингов, которые широко используются для фенотипических анализов, но требуют специальной подготовки. Из-за наличия множественных остатков цистеина идентификация и генерация биологически активных пептидов EPF, которые играют роль в развитии устьиц, были сложными. Таким образом, представленная вторая процедура используется для идентификации устьичных лигандов и мониторинга их биологической активности с помощью биопроб. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он относительно легко дает воспроизводимые данные при одновременном уменьшении количества раствора пептида и времени, необходимого для характеристики роли пептидов в контроле устьичного паттерна и развития. В целом, эти хорошо разработанные протоколы повышают эффективность изучения потенциальных устьичных регуляторов, включая богатые цистеином секреторные пептиды, которые требуют очень сложных структур для своей активности.
Introduction
Правильное структурирование и дифференцировка устьиц растений имеют решающее значение для их функции в двух фундаментальных биологических процессах, фотосинтезе и транспирации, и обеспечиваются сигнальными путями пептида EPF. У Arabidopsis три секретируемых пептида, богатых цистеином, EPF1, EPF2 и STOMAGEN/EPFL9, контролируют различные аспекты развития устьиц и воспринимаются компонентами рецепторов клеточной поверхности, включая рецепторные киназы семейства ERECTA (ER, ERL1 и ERL2), SERK и TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Это распознавание затем приводит к подавлению транскрипционных факторов, которые способствуют дифференцировке устьиц с помощью MAPK-зависимого процесса11. Открытие этих основных генов устьиц в первую очередь достигается путем фенотипического скрининга мутантов с дефектами эпидермиса. В данной работе представлены относительно простые и эффективные методы фенотипирования для визуализации устьиц и других клеток эпидермиса, которые необходимы для идентификации и характеристики потенциальных генов, контролирующих паттерн и дифференцировку устьиц.
Наблюдение за деталями эпидермиса растений обычно достигалось с помощью эпидермальных пилингов с окрашиванием или без окрашивания красителем, таким как толуидиновый синий O (TBO) или сафранин12,13,14. Однако основная проблема этих методов заключается в том, что они требуют специальной подготовки для отшелушивания эпидермиса листа без разрыва тканей, а также для тщательного наблюдения и анализа данных рисунка, избегая изображений, сделанных из разных частей листа. Химическая обработка образцов тканей реагентами, такими как очищающие растворы на основе хлоралгидрата, также широко используется для различных биологических материалов 8,15; Эти методы лечения генерируют большой объем фенотипической информации, предоставляя высококачественные изображения, но также требуют использования опасных химических веществ (например, формальдегида, хлоралгидрата). В этой статье впервые представлен относительно простой и удобный метод фенотипирования, который дает изображения, достаточные для количественного анализа, но не требует использования опасных химических веществ и эпидермальных пилингов листьев для подготовки образца. Окрашенный в ТБО семядольный эпидермис также идеально подходит для изучения развития устьиц, поскольку отсутствие трихом и меньший градиент развития семядолей позволяют легко и легко интерпретировать фенотипы эпидермиса.
Устьичные пептиды EPF относятся к группе растительно-специфических, богатых цистеином пептидов, которые имеют относительно большие зрелые размеры и внутримолекулярные дисульфидные связи между консервативными остатками цистеина. Правильное конформационное сворачивание имеет решающее значение для их биологической функции, но богатые цистеином пептиды, которые продуцируются либо химическим синтезом, либо гетерологичной системой рекомбинации, могут быть неактивными и представлять собой смесь как правильно свернутых, так и развернутых пептидов 3,7,16. Таким образом, скрининг биологически активных пептидов, которые играют роль в контроле развития устьиц, был очень сложной задачей. В этой рукописи дополнительно описан биоанализ для лучшей идентификации и характеристики биологически активных устьичных пептидов. В этом методе проростки арабидопсиса выращивают в многолуночной тарелке, содержащей среду с потенциальными пептидами и без них, в течение 6-7 дней. Затем семядольный эпидермис визуализируется с помощью конфокального микроскопа. В целом, чтобы четко визуализировать биологическую активность потенциальных пептидов в развитии устьиц, генотипы, которые продуцируют больше и/или меньше клеток устьичной линии, такие как мутант epf2, который продуцирует больше клеток эпидермиса, и линия STOMAGEN-ami, которая обеспечивает пониженную плотность эпидермальных клеток 2,4,5, используются в дополнение к контролю Arabidopsis дикого типа (Col-0) для биоанализов.
В целом, два протокола, представленные здесь, могут быть использованы для быстрой и эффективной оценки различных фенотипов эпидермиса и для скрининга малых пептидов и гормонов, которые играют роль в контроле структуры и развития устьиц.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представленные здесь два метода фенотипического анализа для идентификации и характеристики генов, контролирующих паттерн и дифференцировку устьиц, являются удобными и надежными анализами, поскольку протоколы не требуют использования эпидермальных пилингов и специализированного о?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось в рамках программы Discovery Совета по природным ресурсам и инженерным исследованиям Канады (NSERC) и Университета Конкордия. К.Б. поддерживается Национальной зарубежной стипендией Индии.
Materials
| 18 mm x 18 mm cover slip | VWR | 16004-326 | |
| 24-well sterile plates with lid | VWR | CA62406-183 | |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
| 76 x 26 mm Microscope slide | TLG | GEW90-2575-03 | |
| Acetic acid, ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | |
| Bleech | Household bleach (e.g., Clorox) | ||
| Confocal microscope | Nikon | Nikon C2 operated by NIS-Elements | |
| Ethanol | Greenfield | P210EAAN | |
| FIJI | Open-srouce | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Gamborg's vitamin mixture | Cassson Labs | GBL01-100ML | Store at 4 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Growth chambers | Conviron, model E15 | 16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1. | |
| Lights | HD Supply | 25272 | Fluorescent lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 14-222-155 | Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera | |
| Murashige and Skoog basal salts | Cassson Labs | MSP01-1LT | Store at 4 °C |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
| Propidium Iodide | VWR | 39139-064 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.5 | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
References
- Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
- Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
- Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
- Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
- Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
- Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
- Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
- Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
- Nadeau, J. A., Sack, F. D. Control of stomatal distribution on the Arabidopsis leaf surface. Science. 296 (5573), 1697-1700 (2002).
- Meng, X., et al. Differential function of Arabidopsis SERK family receptor-like kinases in stomatal patterning. Current Biology. 25 (18), 2361-2372 (2015).
- Lampard, G. R., Macalister, C. A., Bergmann, D. C. Arabidopsis stomatal initiation is controlled by MAPK-mediated regulation of the bHLH SPEECHLESS. Science. 322 (5904), 1113-1116 (2008).
- Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. The Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
- Theunissen, J. D. An improved method for studying grass leaf epidermis. Stain Technology. 64 (5), 239-242 (1989).
- Venkata, B. P., et al. crw1–A novel maize mutant highly susceptible to foliar damage by the western corn rootworm beetle. PLoS One. 8 (8), 71296 (2013).
- Tucker, M. R., et al. Somatic small RNA pathways promote the mitotic events of megagametogenesis during female reproductive development in Arabidopsis. Development. 139 (8), 1399-1404 (2012).
- Ohki, S., Takeuchi, M., Mori, M. The NMR structure of stomagen reveals the basis of stomatal density regulation by plant peptide hormones. Nature Communications. 2, 512 (2011).
- Jangra, R., et al. Duplicated antagonistic EPF peptides optimize grass stomatal initiation. Development. 148 (16), (2021).
- Zhao, C., Craig, J. C., Petzold, H. E., Dickerman, A. W., Beers, E. P. The xylem and phloem transcriptomes from secondary tissues of the Arabidopsis root-hypocotyl. Plant Physiology. 138 (2), 803-818 (2005).
- Uchida, N., et al. Regulation of inflorescence architecture by intertissue layer ligand-receptor communication between endodermis and phloem. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (16), 6337-6342 (2012).
- Tameshige, T., et al. A secreted peptide and its receptors shape the auxin response pattern and leaf margin morphogenesis. Current Biology. 26 (18), 2478-2485 (2016).
- Abrash, E. B., Davies, K. A., Bergmann, D. C. Generation of signaling specificity in Arabidopsis by spatially restricted buffering of ligand-receptor interactions. The Plant Cell. 23 (8), 2864-2879 (2011).
- Uchida, N., Tasaka, M. Regulation of plant vascular stem cells by endodermis-derived EPFL-family peptide hormones and phloem-expressed ERECTA-family receptor kinases. Journal of Experimental Botany. 64 (17), 5335-5343 (2013).
- Kosentka, P. Z., Overholt, A., Maradiaga, R., Mitoubsi, O., Shpak, E. D. EPFL Signals in the boundary region of the SAM restrict its size and promote leaf initiation. Plant Physiology. 179 (1), 265-279 (2019).
