Identifiering av de gener som är involverade i stomatal utveckling via epidermal fenotyppoäng
Summary
Detta dokument beskriver två fenotypningsmetoder utan användning av epidermal peeling för att karakterisera generna som styr stomatal utveckling. Den första metoden visar hur man analyserar en stomatal fenotyp med användning av en toluidinblå O-färgad växtepidermis. Den andra metoden beskriver hur man identifierar stomatalligander och övervakar deras biologiska aktiviteter.
Abstract
Stomata är små porer på ytan av markväxter som är involverade i gasutbyte och utsläpp av vattenånga, och deras funktion är avgörande för växtproduktivitet och överlevnad. Som sådan har förståelse för mekanismerna genom vilka stomata utvecklas och mönster enormt agronomiskt värde. Denna artikel beskriver två fenotypiska metoder med Arabidopsis cotyledons som kan användas för att karakterisera generna som styr stomatal utveckling och mönstring. Först presenteras procedurer för analys av stomatalfenotyperna med användning av toluidinblå O-färgade cotyledoner. Denna metod är snabb och tillförlitlig och kräver inte användning av epidermal peeling, som ofta används för fenotypiska analyser men kräver specialutbildning. På grund av närvaron av flera cysteinrester har identifieringen och genereringen av bioaktiva EPF-peptider som har en roll i stomatal utveckling varit utmanande. Således presenteras andra är ett förfarande som används för att identifiera stomatalligander och övervaka deras biologiska aktivitet genom bioanalyser. Den största fördelen med denna metod är att den producerar reproducerbara data relativt enkelt samtidigt som mängden peptidlösning minskar och den tid som krävs för att karakterisera peptidernas roll för att kontrollera stomatalmönster och utveckling. Sammantaget förbättrar dessa väl utformade protokoll effektiviteten för att studera de potentiella stomatalregulatorerna, inklusive cysteinrika sekretoriska peptider, som kräver mycket komplexa strukturer för deras aktivitet.
Introduction
Korrekt mönstring och differentiering av växtstomatan är avgörande för deras funktion i två grundläggande biologiska processer, fotosyntes och transpiration, och verkställs av EPF-peptidsignalvägar. I Arabidopsis kontrollerar tre utsöndrade cysteinrika peptider, EPF1, EPF2 och STOMEN / EPFL9, olika aspekter av stomatal utveckling och uppfattas av cellytereceptorkomponenter, inklusive ERECTA-familjens receptorkinaser (ER, ERL1 och ERL2), SERKs och TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Detta erkännande leder sedan till nedreglering av transkriptionsfaktorerna som främjar stomatal differentiering genom en MAPK-beroende process11. Upptäckten av dessa kärnstomatalgener uppnås främst genom fenotypisk screening av mutanter som uppvisar epidermala defekter. Denna artikel presenterar relativt enkla och effektiva fenotypningsmetoder för visualisering av stomata och andra epidermala celler, som krävs för att identifiera och karakterisera de potentiella generna som styr stomatalmönster och differentiering.
Observationen av detaljerna i växtens epidermis har vanligtvis uppnåtts genom att använda epidermala skal med eller utan färgning med ett färgämne såsom toluidinblått O (TBO) eller safranin12,13,14. Den största utmaningen med dessa metoder är dock att de kräver specialiserad träning för att skala bladepidermis utan att riva vävnaderna och att noggrant observera och analysera mönsterdata samtidigt som man undviker bilderna från olika delar av bladet. Kemiska behandlingar för att rensa vävnadsproverna med reagenser såsom klorhydratbaserade clearinglösningar har också använts i stor utsträckning för ett brett spektrum av biologiska material 8,15; Dessa behandlingar genererar en hel del fenotypisk information genom att tillhandahålla högkvalitativa bilder men kräver också användning av farliga kemikalier (t.ex. formaldehyd, klorhydrat). Detta dokument presenterar först en relativt enkel och bekväm fenotypningsmetod som ger bilder som är tillräckliga för kvantitativ analys men kräver inte användning av farliga kemikalier och epidermala bladskal för provberedningen. En TBO-färgad cotyledon-epidermis är också idealisk för studier av stomatal utveckling eftersom bristen på trikomer och den mindre utvecklingsgradienten i cotyledoner möjliggör en enkel och lätthanterlig tolkning av epidermala fenotyper.
Stomatal EPF-peptider tillhör gruppen växtspecifika, cysteinrika peptider som har relativt stora mogna storlekar och intramolekylära disulfidbindningar mellan konserverade cysteinrester. Korrekt konformationsveckning är avgörande för deras biologiska funktion, men cysteinrika peptider, som produceras genom antingen kemisk syntes eller ett heterologt rekombinationssystem, kan vara inaktiva och är en blandning av både korrekt veckade och oveckade peptider 3,7,16. Således har screening av bioaktiva peptider som har en roll för att kontrollera stomatal utveckling varit en mycket utmanande uppgift. Detta manuskript beskriver dessutom en bioassay för bättre identifiering och karakterisering av bioaktiva stomatalpeptider. I denna metod odlas Arabidopsisplantor i en flerbrunnsplatta innehållande media med och utan potentiella peptider i 6-7 dagar. Därefter visualiseras cotyledon-epidermis med hjälp av ett konfokalmikroskop. I allmänhet, för att tydligt visualisera den biologiska aktiviteten hos potentiella peptider i stomatal utveckling, används genotyperna som producerar mer och / eller mindre stomatala linjeceller, såsom epf2-mutanten, som producerar fler epidermala celler, och STOMAGEN-ami-linjen, som ger minskad epidermal celldensitet 2,4,5, förutom vildtypskontrollen Arabidopsis (Col-0) för bioanalyserna.
Sammantaget kan de två protokollen som presenteras här användas för snabb och effektiv bedömning av olika epidermala fenotyper och för screening av små peptider och hormoner som har en roll i att kontrollera stomatal mönstring och utveckling.
Protocol
Representative Results
Discussion
De två fenotypiska analysmetoderna för att identifiera och karakterisera generna som styr stomatalmönstring och differentiering som presenteras här är praktiska och tillförlitliga analyser eftersom protokollen inte kräver användning av epidermala skal och specialutrustning (som är tidskrävande och kräver särskild utbildning för provberedning) men producerar högkvalitativa bilder för kvantitativ analys av epidermala fenotyper.
En begränsning med denna teknik för fenotypisk anal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning finansierades genom Natural Resources and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery-programmet och Concordia University. K.B. stöds av National Overseas Scholarship från Indien.
Materials
| 18 mm x 18 mm cover slip | VWR | 16004-326 | |
| 24-well sterile plates with lid | VWR | CA62406-183 | |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
| 76 x 26 mm Microscope slide | TLG | GEW90-2575-03 | |
| Acetic acid, ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | |
| Bleech | Household bleach (e.g., Clorox) | ||
| Confocal microscope | Nikon | Nikon C2 operated by NIS-Elements | |
| Ethanol | Greenfield | P210EAAN | |
| FIJI | Open-srouce | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Gamborg's vitamin mixture | Cassson Labs | GBL01-100ML | Store at 4 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Growth chambers | Conviron, model E15 | 16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1. | |
| Lights | HD Supply | 25272 | Fluorescent lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 14-222-155 | Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera | |
| Murashige and Skoog basal salts | Cassson Labs | MSP01-1LT | Store at 4 °C |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
| Propidium Iodide | VWR | 39139-064 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.5 | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
References
- Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
- Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
- Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
- Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
- Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
- Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
- Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
- Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
- Nadeau, J. A., Sack, F. D. Control of stomatal distribution on the Arabidopsis leaf surface. Science. 296 (5573), 1697-1700 (2002).
- Meng, X., et al. Differential function of Arabidopsis SERK family receptor-like kinases in stomatal patterning. Current Biology. 25 (18), 2361-2372 (2015).
- Lampard, G. R., Macalister, C. A., Bergmann, D. C. Arabidopsis stomatal initiation is controlled by MAPK-mediated regulation of the bHLH SPEECHLESS. Science. 322 (5904), 1113-1116 (2008).
- Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. The Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
- Theunissen, J. D. An improved method for studying grass leaf epidermis. Stain Technology. 64 (5), 239-242 (1989).
- Venkata, B. P., et al. crw1–A novel maize mutant highly susceptible to foliar damage by the western corn rootworm beetle. PLoS One. 8 (8), 71296 (2013).
- Tucker, M. R., et al. Somatic small RNA pathways promote the mitotic events of megagametogenesis during female reproductive development in Arabidopsis. Development. 139 (8), 1399-1404 (2012).
- Ohki, S., Takeuchi, M., Mori, M. The NMR structure of stomagen reveals the basis of stomatal density regulation by plant peptide hormones. Nature Communications. 2, 512 (2011).
- Jangra, R., et al. Duplicated antagonistic EPF peptides optimize grass stomatal initiation. Development. 148 (16), (2021).
- Zhao, C., Craig, J. C., Petzold, H. E., Dickerman, A. W., Beers, E. P. The xylem and phloem transcriptomes from secondary tissues of the Arabidopsis root-hypocotyl. Plant Physiology. 138 (2), 803-818 (2005).
- Uchida, N., et al. Regulation of inflorescence architecture by intertissue layer ligand-receptor communication between endodermis and phloem. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (16), 6337-6342 (2012).
- Tameshige, T., et al. A secreted peptide and its receptors shape the auxin response pattern and leaf margin morphogenesis. Current Biology. 26 (18), 2478-2485 (2016).
- Abrash, E. B., Davies, K. A., Bergmann, D. C. Generation of signaling specificity in Arabidopsis by spatially restricted buffering of ligand-receptor interactions. The Plant Cell. 23 (8), 2864-2879 (2011).
- Uchida, N., Tasaka, M. Regulation of plant vascular stem cells by endodermis-derived EPFL-family peptide hormones and phloem-expressed ERECTA-family receptor kinases. Journal of Experimental Botany. 64 (17), 5335-5343 (2013).
- Kosentka, P. Z., Overholt, A., Maradiaga, R., Mitoubsi, O., Shpak, E. D. EPFL Signals in the boundary region of the SAM restrict its size and promote leaf initiation. Plant Physiology. 179 (1), 265-279 (2019).
