Identifikation af de gener, der er involveret i stomatal udvikling via epidermal fænotype scoring

Summary

Dette papir beskriver to fænotypemetoder uden brug af epidermale skræl til at karakterisere de gener, der styrer stomatal udvikling. Den første metode demonstrerer, hvordan man analyserer en stomatal fænotype ved hjælp af en toluidinblå O-farvet planteepidermis. Den anden metode beskriver, hvordan man identificerer stomatale ligander og overvåger deres biologiske aktiviteter.

Abstract

Stomata er små porer på overfladen af landplanter, der er involveret i gasudveksling og frigivelse af vanddamp, og deres funktion er kritisk for planteproduktivitet og overlevelse. Som sådan har forståelse af de mekanismer, hvormed stomata udvikler sig og mønster, enorm agronomisk værdi. Dette papir beskriver to fænotypiske metoder ved hjælp af Arabidopsis-cotyledoner , der kan bruges til at karakterisere de gener, der styrer stomatal udvikling og mønster. Præsenteret først er procedurer til analyse af stomatale fænotyper ved anvendelse af toluidinblå O-farvede cotyledoner. Denne metode er hurtig og pålidelig og kræver ikke brug af epidermale skræl, som i vid udstrækning anvendes til fænotypiske analyser, men kræver specialuddannelse. På grund af tilstedeværelsen af flere cysteinrester har identifikation og generering af bioaktive EPF-peptider, der spiller en rolle i stomatal udvikling, været udfordrende. Således præsenteres anden en procedure, der anvendes til at identificere stomatale ligander og overvåge deres biologiske aktivitet ved bioassays. Den største fordel ved denne metode er, at den relativt let producerer reproducerbare data, samtidig med at mængden af peptidopløsning og den tid, der kræves for at karakterisere peptidernes rolle i styringen af stomatal mønster og udvikling, reduceres. Samlet set forbedrer disse veldesignede protokoller effektiviteten ved at studere de potentielle stomatale regulatorer, herunder cysteinrige sekretoriske peptider, som kræver meget komplekse strukturer for deres aktivitet.

Introduction

Korrekt mønster og differentiering af plantestomaterne er afgørende for deres funktion i to grundlæggende biologiske processer, fotosyntese og transpiration, og håndhæves af EPF-peptidsignalveje. I Arabidopsis styrer tre udskillede cysteinrige peptider, EPF1, EPF2 og STOMAGEN / EPFL9, forskellige aspekter af stomatal udvikling og opfattes af celleoverfladereceptorkomponenter, herunder ERECTA-familie receptorkinaser (ER, ERL1 og ERL2), SERK’er og TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Denne anerkendelse fører derefter til nedregulering af transkriptionsfaktorerne, der fremmer stomatal differentiering ved en MAPK-afhængig proces¹¹. Opdagelsen af disse kernestomatale gener opnås primært ved fænotypisk screening af mutanter, der udviser epidermale defekter. Dette papir præsenterer relativt enkle og effektive fænotypemetoder til visualisering af stomata og andre epidermale celler, som er nødvendige for at identificere og karakterisere de potentielle gener, der styrer stomatal mønster og differentiering.

Observationen af detaljerne i plantens epidermis er typisk opnået ved at bruge epidermale skræl med eller uden farvning med et farvestof som toluidinblåt O (TBO) eller safranin^12,13,14. Den største udfordring ved disse metoder er imidlertid, at de kræver specialuddannelse for at skrælle bladepidermis uden at rive vævene og omhyggeligt observere og analysere mønsterdataene, samtidig med at man undgår billederne taget fra forskellige dele af bladet. Kemiske behandlinger til fjernelse af vævsprøver med reagenser såsom chloralhydratbaserede clearingopløsninger er også blevet anvendt i vid udstrækning til en række biologiske materialer ^8,15; Disse behandlinger genererer en masse fænotypiske oplysninger ved at give billeder af høj kvalitet, men kræver også brug af farlige kemikalier (f.eks. Formaldehyd, chloralhydrat). Dette papir præsenterer først en relativt nem og bekvem fænotypemetode, der producerer billeder, der er tilstrækkelige til kvantitativ analyse, men ikke kræver brug af farlige kemikalier og epidermale bladskaller til prøveforberedelsen. En TBO-farvet cotyledon epidermis er også ideel til undersøgelse af stomatal udvikling, fordi manglen på trichomer og den mindre udviklingsgradient i cotyledoner muliggør den enkle og medgørlige fortolkning af de epidermale fænotyper.

Stomatale EPF-peptider tilhører gruppen af plantespecifikke, cysteinrige peptider, der har relativt store modne størrelser og intramolekylære disulfidbindinger mellem konserverede cysteinrester. Korrekt konformationel foldning er afgørende for deres biologiske funktion, men cysteinrige peptider, der produceres ved enten kemisk syntese eller et heterologt rekombinationssystem, kan være inaktive og er en blanding af både korrekt foldede og ufoldede peptider ^3,7,16. Således har screening af bioaktive peptider, der spiller en rolle i at kontrollere stomatal udvikling, været en meget udfordrende opgave. Dette manuskript beskriver desuden et bioassay til bedre identifikation og karakterisering af bioaktive stomatale peptider. I denne metode dyrkes Arabidopsis-frøplanter i en multibrøndplade indeholdende medier med og uden potentielle peptider i 6-7 dage. Derefter visualiseres cotyledon epidermis ved hjælp af et konfokalmikroskop. For klart at visualisere den biologiske aktivitet af potentielle peptider i stomatal udvikling anvendes generelt de genotyper, der producerer mere og / eller mindre stomatale afstamningsceller, såsom epf2-mutanten, der producerer flere epidermale celler, og STOMAGEN-ami-linjen, der giver reduceret epidermal celletæthed ^2,4,5, ud over vildtype Arabidopsis-kontrollen (Col-0) til bioassays.

Samlet set kan de to protokoller, der præsenteres her, bruges til hurtig og effektiv vurdering af forskellige epidermale fænotyper og til screening af små peptider og hormoner, der spiller en rolle i styringen af stomatal mønster og udvikling.

Protocol

1. Farvning af Arabidopsis-cotyledoner med TBO Frøsterilisering og vækstbetingelserSteriliser ~ 30 Arabidopsis frø pr. Genotype i et mikrocentrifugerør ved at tilsætte 1 ml af en frøsteriliseringsopløsning (33% kommercielt blegemiddel, 0,1% Triton X-100), og rock forsigtigt i 10-12 minutter ved stuetemperatur (RT).BEMÆRK: Steriliser ~ 30 frø af vildtypen Arabidopsis tiltrædelse Columbia (Col-0) og / eller ~ 60 frø af transgene planter, der bære…

Representative Results

Forskellige transgene stomatale planter og mutanter, der vides at have mindre eller mere stomatal tæthed og klyngedannelse (epf2 2,5, epf1 epf2 2,5, tmm12, en STOMAGEN-tavs linje4 og transgene linjer, der bærer den østradiol-inducerbare Est::EPF1 eller Est::EPF2 overekspressionskonstruktion7 …

Discussion

De to fænotypiske analysemetoder til identifikation og karakterisering af de gener, der styrer stomatal mønster og differentiering, der præsenteres her, er praktiske og pålidelige assays, da protokollerne ikke kræver brug af epidermale skræl og specialudstyr (som er tidskrævende og kræver særlig træning til prøveforberedelse), men producerer billeder af høj kvalitet til kvantitativ analyse af epidermale fænotyper.

En begrænsning af denne teknik til fænotypisk analyse ved hjælp …

Materials

18 mm x 18 mm cover slip	VWR	16004-326
24-well sterile plates with lid	VWR	CA62406-183
3M Micropore surgical tape	Fisher Scientific	19-027-761	Microporous surgical paper tape used to seal MS plates
76 x 26 mm Microscope slide	TLG	GEW90-2575-03
Acetic acid, ≥99.8%	Fisher Scientific	A38-212
Agar	BioShop	AGR001.1
Bleech	Household bleach (e.g., Clorox)
Confocal microscope	Nikon		Nikon C2 operated by NIS-Elements
Ethanol	Greenfield	P210EAAN
FIJI	Open-srouce	(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j	Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/
Forceps	Sigma-Aldrich	F6521
Gamborg's vitamin mixture	Cassson Labs	GBL01-100ML	Store at 4 °C
Glycerol	Fisher Scientific	G33-4
Growth chambers	Conviron, model E15		16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1.
Lights	HD Supply	25272	Fluorescent  lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K
Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	14-222-155	Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization
Microscope	Nikon		Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera
Murashige and Skoog basal salts	Cassson Labs	MSP01-1LT	Store at 4 °C
Petri Dish 100 mm x 20 mm	Fisher Scientific	08-757-11Z	Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana
Propidium Iodide	VWR	39139-064
Scalpel	Fisher Scientific	08-916-5A
Sucrose	BioShop	SUC700.5
Toluidine blue O	Sigma-Aldrich	T3260-5G
Tris base	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-100ML
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758