Metodiken hjälper till vid analys av variation i DNA-replikationsdynamik i närvaro av nanopartiklar. Olika metoder kan antas baserat på cytotoxicitetsnivån för materialet av intresse. Dessutom tillhandahålls en beskrivning av bildanalysen för att hjälpa till vid DNA-fiberanalys.
Exponering för nanomaterial kan orsaka replikationsstress och genomisk instabilitet i celler. Graden av instabilitet beror på nanomaterialens kemi, storlek och koncentration, exponeringstiden och den exponerade celltypen. Flera etablerade metoder har använts för att belysa hur endogena/exogena medel påverkar global replikering. Analyser på svarsnivå, såsom DNA-fiberanalysen, är dock absolut nödvändiga för att förstå hur dessa medel påverkar replikationsinitiering, avslutningar och replikationsgaffelprogression. Att veta detta gör att man bättre kan förstå hur nanomaterial ökar risken för mutationsfixering och genomisk instabilitet. Vi använde RAW 264.7 makrofager som modellceller för att studera replikationsdynamiken under exponering för grafenoxidnanopartiklar. Här demonstrerar vi det grundläggande protokollet för DNA-fiberanalysen, som inkluderar pulsmärkning med nukleotidanaloger, celllys, spridning av de pulsmärkta DNA-fibrerna på objektglas, fluorescerande immunfärgning av nukleotidanalogerna i DNA-fibrerna, avbildning av replikationsintermediärerna inom DNA-fibrerna med hjälp av konfokalmikroskopi och replikationsintermediär analys med hjälp av en datorstödd poäng- och analysprogramvara (CASA).
Under varje cellcykel säkerställer DNA-replikation noggrann genomduplicering1. Eukaryot kromosomal replikation beror i huvudsak på tre faktorer: tidpunkten för avfyrningen av flera replikeringsursprung, hastigheten på gafflarna som kommer från de utlösta ursprungen och avslutningen av replikeringsprocessen när två replikeringsgafflar från intilliggande ursprung möts2. För högkvalitativ överföring av genetisk information till dotterceller, liksom bevarande av genetisk integritet, är korrekt DNA-replikation avgörande. Medel som utvecklas från regelbunden metabolism eller beror på konstgjorda eller naturliga miljömaterial attackerar ständigt genomet. Dessa endogena och exogena medel orsakar replikationsgafflar att sakta ner eller stoppa på grund av att de stöter på DNA-skador orsakade av dessa medel, och gafflarna som tillfälligt saktar ner eller stannar som svar på dessa svårigheter kallas replikationsstress3. Som svar på replikationsstress har celler utvecklat flera molekylära vägar som upprätthåller stabiliteten hos de störda replikationsgafflarna och tillåter dem att starta om4. När det gäller genetisk stabilitet, cellöverlevnad och mänsklig sjukdom har dessa replikationsstressresponsmekanismer framträtt som nyckelfaktorerna för att upprätthålla ett hälsosamt genom, säkerställa cellöverlevnad och minska sannolikheten för sjukdomsbildning5.
Ett av de exogena medel som kan producera replikationsstress är nanopartiklar. Nanopartiklar är partiklar som varierar i storlek från 1 nm till 100 nm6. På grund av deras höga ytor, distinkta former och unika kemiska egenskaper används nanopartiklar i olika medicinska, farmaceutiska, miljömässiga och industriella applikationer 7,8. Medan nanopartiklar har många potentiella fördelar kan vissa av dem (på grund av deras ärftliga natur eller livslängd) bli giftiga. Nanopartiklar kan också bildas på grund av det naturliga slitaget på medicinska implantat och släppas ut i periprotesregionen 9,10.
På grund av människors exponering för en myriad av nanopartiklar som produceras för olika tillämpningar har forskningen inom nanopartikeltoxicitet ökat enormt under de senaste 10 åren11. Även om dessa forskningsinsatser har avslöjat information i överflöd om det potentiella hot som nanopartiklar utgör för människors hälsa, är kunskapen om potentialen för nanopartiklar att orsaka genotoxicitet fortfarande begränsad. Vad som hittills har upptäckts är att dessa nanopartiklar fysiskt kan interagera med DNA, främja DNA-skador och skada eller störa proteinerna som är ansvariga för att reparera eller replikera DNA12. För att upptäcka hur de stör DNA-replikation används vanligtvis DNA-fiberkamning, radioresistent DNA-syntes (RDS) och DNA-fiberanalys13,14,15,16.
DNA-fiberkamningsmetoden är flexibel och ger information om replikationsgaffeldynamik på enmolekylnivå17. I huvudsak dras ett saliniserat täckglas försiktigt från DNA-lösningen när DNA-ändarna binder till den. DNA-molekylerna rätas ut och justeras av lösningens menisk. DNA-fibrernas homogenitet, avstånd och inriktning stöder noggranna och pålitliga mätningar av fiberkanallängden. Genom att justera längden och sekvensen av behandlingarna och de läkemedel som används för att orsaka stress eller skada kan många aspekter av gaffelframsteg övervakas med hjälp av denna applikation. I denna metod används ett dubbelt märkningssystem, genom vilket replikeringsgaffelns hastighet och progression bedöms17,18. Å andra sidan utnyttjar 2D-gelelektrofores det faktum att i agarosgelelektrofores färdas förgrenande DNA-strukturer långsammare än linjära DNA-molekyler av samma massa, vilket möjliggör en ren separation av de två i en 2D-körning. Faktum är att denna metod undersöks för att segregera DNA-molekyler baserat på deras massa i den första körningen och baserat på deras form i den andra ortogonala körningen. Efter genomisk DNA-fragmentering utvecklar de ovanliga replikations- och rekombinationsintermediärerna en förgreningsform, och de kan särskiljas från de vanligare linjära molekylerna i 2D-gel19.
RDS-metoden används för att bestämma hur global DNA-syntes påverkas. I denna metod bestäms graden av hämning av global replikation genom att jämföra mängden inkorporerade radioaktivt märkta nukleotider, såsom [14C] tymidin, i obehandlade kontra behandlade celler14,20. Den procentuella skillnaden i radiomärkning mellan de obehandlade och behandlade cellerna representerar i vilken grad det DNA-skadliga medlet påverkar DNA-syntesen. I likhet med detta använder en annan metod cellernas förmåga att integrera nukleotidanaloger som BrdU (5-brom-2′-deoxiuridin) för flödescytometri för att mäta de totala hastigheterna för DNA-syntes21,22. Medan dessa metoder visar hur DNA-skadliga medel påverkar global DNA-syntes, visar de inte hur enskilda replicons påverkas. Analyser på svarsnivå är absolut nödvändiga för att bättre förstå initieringen och omfattningen av genomisk instabilitet i händelse av exponering för toxiska partiklar (nanomaterial). DNA-fiberautoradiografi och elektronmikroskopi är några metoder som används för att bestämma detta23,24,25,26.
Begreppen replikationsbubblor och dubbelriktad replikation från ojämnt fördelade källor utvecklades först med hjälp av enmolekylära tester som elektronmikroskopi och DNA-fiberautoradiografi27,28. Den direkta observationen av förgreningsreplikationsintermediärer på specifika molekyler dispergerade över ett kolbelagt rutnät underlättas avsevärt av elektronmikroskopi. Denna metod, som fortfarande används idag för att spåra patologiska skift vid replikationsgafflar, användes för att lokalisera det första eukaryota ursprunget till DNA-replikation28. Fiber autoradiografi är centrerad kring begreppet autoradiografisk identifiering av nyligen replikerade områden och pulsmärkning av kromosomer med tritierad tymidin. Den första kvantitativa utvärderingen av ursprungstätheter och replikationsgaffelhastigheter i metazoa genomiska sekvenser möjliggjordes av DNA-fiberautoradiografi29.
För närvarande har fiberfluorografimetoder tagit plats för autoradiografi, främst för att fiberfluorografi är mycket snabbare än autoradiografi. I fiberfluorografi införlivas två halogenerade nukleotidderivat, såsom brom- (Br), klor- (Cl) eller joddeoxiuridin (IdU), sekventiellt i nyligen replikerat DNA och identifieras sedan genom indirekt immunofluorescens med användning av antikroppar30. Mikroskopisk visning av det framväxande DNA som har införlivat en eller båda analogerna möjliggörs genom immunfärgning av en av analogerna i en färg och den andra analogen i en annan färg (t.ex. immunfärgning av begynnande DNA med inkorporerat IdU-rött och inkorporerat CldU-grönt) (figur 1)21. Många olika typer av replikationsintermediärer kan identifieras genom DNA-fiberanalys. De vanligast studerade är enskilda töjningsgafflar, initieringar och avslutningar. Enskilda töjbara gafflar har ett replikeringsmönster av rött följt av grönt (rödgrönt; Figur 2A). 13 Längden på dessa intermediärer används ofta för att mäta gaffelhastigheten (dvs. gaffellängd/pulstid) eller den exonukleolytiska nedbrytningen av begynnande DNA genom spårförkortning (figur 2E)30,31,32. I en studie av Mimitou et al. fann man att vid långvarig exponering för hydroxiurea, ett replikationsgift som orsakar dubbelsträngsbrott i DNA, rekryterades RE1133. MRE11 är ett exonukleas som är känt för sin 3′-5′ exonukleasaktivitet, och det kan skära ändarna av DNA för reparation. Därför kan man, när man utsätts för giftiga ämnen, observera exonukleolytisk nedbrytning av begynnande DNA, vilket är förkortningen av DNA-strängen på grund av exponering för ett DNA-skadligt medel34.
Replikationsgaffelbrott orsakade av fysiska hinder (DNA-proteinkomplex eller DNA-lesioner), kemiska hinder eller mutationer kan stoppa replikationen och kräva homolog rekombination för att starta om den. Detta kallas nedsatt gaffelprogression. Många in vitro- och in vivo-undersökningar har indikerat att transkription ibland kan förhindra framsteg med replikationsgaffel på detta sätt35.
Initieringar är replikationsursprung som initierar och utlöses under den första eller andra pulsen. Ursprung som avfyras under den första pulsen och har replikationsgafflar som fortsätter att vara aktiva har ett grön-röd-grönt mönster (figur 2B, lägre). Ursprung som initieras under den andra pulsen har ett grönt mönster (figur 2B, övre) och kallas ibland nyinitierat ursprung, så dessa ursprung kan särskiljas från de som initieras under den första pulsen. Jämförelsen av de relativa procentandelarna av nyligen avfyrade ursprung mellan två experimentella förhållanden gör att man kan förstå hur en cell svarar på ett DNA-skadligt medel eller närvaron eller frånvaron av ett protein. Avslutningar skapas när två replikeringsgafflar från intilliggande replicons sammanfogas och de har ett röd-grön-rött mönster (figur 2D)30.
Baserat på de fakta som beskrivs ovan anses DNA-fiberanalys för närvarande vara en föredragen metod för att studera variationen i DNA-replikationsdynamik orsakad av giftiga ämnen såsom nanomaterial. Forskare har nu en god förståelse och kunskap om dynamiken i genomomfattande DNA-replikation i eukaryoter, både kvantitativt och kvalitativt, på grund av upptäckten av denna teknik36. Baserat på utfallsvariablerna kan flera metoder användas. Några exempel på metoder för att studera variationer i DNA-skador inducerade av externa agenter/nanopartiklar visas i figur 3. Det övergripande målet med DNA-fiberanalysmetoden som beskrivs i denna studie är att bestämma hur nanopartiklar påverkar replikationsprocessen in vitro och hur de påverkar olika vävnader differentiellt.
Vi diskuterar här en metod för att hjälpa till med analysen av variationen i DNA-replikationsdynamik i närvaro av nanopartiklar genom DNA-fiberanalysen. Viktiga kritiska steg som ingår i standardtestet beskrivs i protokollet (steg 2.2.2 och steg 3.1.3). Det rekommenderas alltid att använda ett område med begränsad exponering för takljus och konstant luftflöde för att förhindra ljusinducerade DNA-brott i objektglasen samt för att förbättra reproducerbarheten. Noggrann uppmärksamhet krävs på tidslängden …
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner ekonomiskt stöd från Blazer-stiftelsen, Medical Biotechnology Program vid Biomedical Sciences, UIC Rockford och Institutionen för hälsovetenskaplig utbildning, UIC Rockford. Författarna tackar Ananya Sangineni och James Bradley för deras bidrag till projektet.
24 well plate | Fisher brand | FB012929 | |
Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
Alexa flour 594 goat anti-rabbit | Invitrogen | A11037 | |
Alexa fluor 488 chicken anti-rat | Invitrogen | A21470 | |
Alexa fluor 488 goat anti-chicken | Invitrogen | A11039 | |
Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse | Invitrogen | A11062 | |
BSA | Sigma Aldrich | A2153 | |
CldU | Sigma Aldrich | 50-90-8 | |
Coverslips (22 x 50 mm) | Fisher brand | 12-545-EP | |
EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
Frosted Microscope Slides | Fisher brand | 12-550-11 | |
Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 320331 | |
IdU | Sigma Aldrich | 54-42-2 | |
Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | |
Mouse Anti-BrdU | BD Biosciences | 347580 | |
Phosphate Buffer Saline | Gibco | 10010072 | |
Rat anti-BrdU | Abcam | BU1–75(ICR1) | |
Raw 264.5 macrophage cells | ATCC | TIB-71 | |
SDS | Sigma Aldrich | L3771 | |
Silane-Prep slides | Sigma Aldrich | S4651-72EA | |
Superfrost gold plus slides | Fischer scientific | 22-035813 | |
Tris pH 7.4 | Sigma Aldrich | 77861 | |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |