تساعد المنهجية في تحليل التباين في ديناميكيات تكرار الحمض النووي في وجود الجسيمات النانوية. يمكن اعتماد منهجيات مختلفة بناء على مستوى السمية الخلوية للمادة ذات الأهمية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير وصف لتحليل الصورة للمساعدة في تحليل ألياف الحمض النووي.
يمكن أن يسبب التعرض للمواد النانوية إجهاد النسخ المتماثل وعدم الاستقرار الجيني في الخلايا. تعتمد درجة عدم الاستقرار على كيمياء وحجم وتركيز المواد النانوية ووقت التعرض ونوع الخلية المكشوفة. وقد استخدمت عدة أساليب راسخة لتوضيح كيفية تأثير العوامل الداخلية/الخارجية على التكرار العالمي. ومع ذلك ، فإن المقايسات على مستوى replicon ، مثل مقايسة ألياف الحمض النووي ، ضرورية لفهم كيفية تأثير هذه العوامل على بدء النسخ المتماثل ، والإنهاءات ، وتطور شوكة النسخ المتماثل. إن معرفة ذلك يسمح للمرء أن يفهم بشكل أفضل كيف تزيد المواد النانوية من فرص تثبيت الطفرة وعدم الاستقرار الجينومي. استخدمنا بلاعم RAW 264.7 كخلايا نموذجية لدراسة ديناميكيات النسخ المتماثل تحت التعرض لجسيمات أكسيد الجرافين النانوية. هنا ، نوضح البروتوكول الأساسي لفحص ألياف الحمض النووي ، والذي يتضمن وضع العلامات النبضية مع نظائر النوكليوتيدات ، وتحلل الخلية ، ونشر ألياف الحمض النووي ذات العلامات النبضية على الشرائح ، والتلوين المناعي الفلوري لنظائر النوكليوتيدات داخل ألياف الحمض النووي ، وتصوير وسيطة النسخ المتماثل داخل ألياف الحمض النووي باستخدام المجهر متحد البؤر ، والتحليل الوسيط للنسخ المتماثل باستخدام برنامج التسجيل والتحليل بمساعدة الكمبيوتر (CASA).
خلال كل دورة خلية ، يضمن تكرار الحمض النووي تكرار الجينوم بدقة1. يعتمد تكرار الكروموسومات حقيقية النواة بشكل أساسي على ثلاثة عوامل: توقيت إطلاق أصول النسخ المتماثل المتعددة ، وسرعة الشوكات التي تظهر من الأصول المطلقة ، وإنهاء عملية النسخ المتماثل عندما يلتقي شوكان متماثلان من أصول متجاورة2. من أجل نقل المعلومات الوراثية بدقة عالية إلى الخلايا الوليدة ، وكذلك الحفاظ على السلامة الوراثية ، يعد تكرار الحمض النووي بدقة أمرا بالغ الأهمية. العوامل التي تتطور من التمثيل الغذائي المنتظم أو بسبب المواد البيئية الاصطناعية أو الطبيعية تهاجم الجينوم باستمرار. تتسبب هذه العوامل الداخلية والخارجية في إبطاء أو توقف شوكات النسخ المتماثل بسبب مواجهة تلف الحمض النووي الناجم عن هذه العوامل ، وتسمى الشوكات التي تتباطأ مؤقتا أو تتوقف استجابة لهذه الصعوبات إجهاد النسخ المتماثل3. استجابة لإجهاد النسخ المتماثل ، طورت الخلايا العديد من المسارات الجزيئية التي تحافظ على استقرار شوكات النسخ المتماثل المضطربة وتسمح لها بإعادة التشغيل4. من حيث الاستقرار الجيني ، وبقاء الخلايا ، والأمراض البشرية ، ظهرت آليات الاستجابة للإجهاد المتماثل هذه كعوامل رئيسية للحفاظ على جينوم صحي ، وضمان بقاء الخلية ، وتقليل احتمالية تكوين المرض5.
أحد العوامل الخارجية القادرة على إنتاج إجهاد النسخ المتماثل هو الجسيمات النانوية. الجسيمات النانوية هي جسيمات يتراوح حجمها من 1 نانومتر إلى 100 نانومتر6. نظرا لمساحات سطحها العالية وأشكالها المميزة وخصائصها الكيميائية الفريدة ، تستخدم الجسيمات النانوية في مختلف التطبيقات الطبية والصيدلانية والبيئية والصناعية 7,8. في حين أن الجسيمات النانوية لها الكثير من الفوائد المحتملة ، فإن بعضها (بسبب طبيعتها الموروثة أو طول عمرها) يمكن أن يصبح ساما. يمكن أن تتشكل الجسيمات النانوية أيضا بسبب البلى الطبيعي للغرسات الطبية ويتم إطلاقها في المنطقة المحيطة بالأطراف الاصطناعية 9,10.
نظرا لتعرض البشر لعدد لا يحصى من الجسيمات النانوية المنتجة لتطبيقات مختلفة ، زادت الأبحاث في مجال سمية الجسيمات النانوية بشكل كبير خلال السنوات العشر الماضية11. في حين أن هذه الجهود البحثية قد كشفت عن معلومات وفيرة حول التهديد المحتمل الذي تشكله الجسيمات النانوية على صحة الإنسان ، فإن المعرفة حول إمكانية تسبب الجسيمات النانوية في السمية الجينية لا تزال محدودة. ما تم اكتشافه حتى الآن هو أن هذه الجسيمات النانوية يمكن أن تتفاعل جسديا مع الحمض النووي ، وتعزز تلف الحمض النووي ، وتتلف أو تتداخل مع البروتينات المسؤولة عن إصلاح أو تكرار الحمض النووي12. للكشف عن كيفية تداخلها مع تكرار الحمض النووي ، عادة ما يتم استخدام تمشيط ألياف الحمض النووي ، وتخليق الحمض النووي المقاوم للإشعاع (RDS) ، وتحليل ألياف الحمض النووي13،14،15،16.
طريقة تمشيط ألياف الحمض النووي مرنة وتعطي معلومات حول ديناميكيات شوكة النسخ المتماثل على مستوىالجزيء الواحد 17. في جوهرها ، يتم سحب غطاء مملح برفق من محلول الحمض النووي بمجرد أن ترتبط أطراف الحمض النووي به. تستقيم جزيئات الحمض النووي (DNA) وتصطف بواسطة السطح الهلالي للمحلول. يدعم تجانس وتباعد ومحاذاة ألياف الحمض النووي قياسات دقيقة ويمكن الاعتماد عليها لطول مجرى الألياف. من خلال ضبط طول وتسلسل العلاجات والأدوية المستخدمة للتسبب في الإجهاد أو الضرر ، يمكن مراقبة العديد من جوانب تقدم الشوكة باستخدام هذا التطبيق. في هذه الطريقة ، يتم استخدام نظام وضع العلامات المزدوج ، والذي يتم من خلاله تقييم سرعة وتقدم شوكة النسخ المتماثل17,18. من ناحية أخرى ، يستفيد الرحلان الكهربائي 2D gel من حقيقة أنه في الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز ، تنتقل هياكل الحمض النووي المتفرعة بشكل أبطأ من جزيئات الحمض النووي الخطية من نفس الكتلة ، مما يسمح بالفصل النظيف بين الاثنين في تشغيل 2D. في الواقع ، تم فحص هذه الطريقة لفصل جزيئات الحمض النووي بناء على كتلتها في الجولة الأولى وبناء على شكلها في الجولة الثانية المتعامدة. بعد تجزئة الحمض النووي الجينومي ، تطور المواد الوسيطة غير الشائعة للتكرار وإعادة التركيب شكلا متفرعا ، ويمكن تمييزها عن الجزيئات الخطية الأكثر شيوعا في 2D gel19.
تستخدم طريقة RDS لتحديد كيفية تأثر تخليق الحمض النووي العالمي. في هذه الطريقة ، يتم تحديد درجة تثبيط التكرار العالمي من خلال مقارنة كمية النيوكليوتيدات المدمجة ذات العلامات الإشعاعية ، مثل [14C] ثيميدين ، في الخلايا غير المعالجة مقابل الخلايا المعالجة14,20. تمثل النسبة المئوية للفرق في وضع العلامات الإشعاعية بين الخلايا غير المعالجة والمعالجة الدرجة التي يؤثر بها العامل المدمر للحمض النووي على تخليق الحمض النووي. على غرار ذلك ، تستخدم طريقة أخرى قدرة الخلايا على دمج نظائر النوكليوتيدات مثل BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) لقياس التدفق الخلوي لقياس المعدلات الإجمالية لتخليق الحمض النووي21,22. في حين أن هذه الطرق توضح كيف تؤثر العوامل الضارة بالحمض النووي على تخليق الحمض النووي العالمي ، إلا أنها لا تظهر كيف تتأثر التكرارات الفردية. في الواقع ، تعد المقايسات على مستوى replicon ضرورية لفهم أفضل لبدء ومدى عدم الاستقرار الجيني في حالة التعرض للجسيمات السامة (المواد النانوية). التصوير الشعاعي الذاتي لألياف الحمض النووي والمجهر الإلكتروني هي بعض الطرق المستخدمة لتحديد هذا23،24،25،26.
تم تطوير مفاهيم فقاعات النسخ المتماثل والنسخ المتماثل ثنائي الاتجاه من مصادر متباعدة بشكل متساو لأول مرة باستخدام اختبارات أحادية الجزيء مثل المجهر الإلكتروني والتصوير الشعاعي الذاتي لألياف الحمض النووي27,28. يتم تسهيل المراقبة المباشرة لوسيطات النسخ المتماثل المتفرعة على جزيئات محددة منتشرة عبر شبكة مغلفة بالكربون بشكل كبير بواسطة المجهر الإلكتروني. تم استخدام هذه الطريقة ، التي لا تزال قيد الاستخدام حتى اليوم لتتبع التحولات المرضية في شوكات النسخ المتماثل ، لتحديد أول أصل حقيقي النواة لتكرار الحمض النووي28. يتمحور التصوير الشعاعي الذاتي للألياف حول مفهوم التحديد الشعاعي الذاتي للمناطق المكررة حديثا ووضع علامات نبضية على الكروموسومات باستخدام الثيميدين الثلاثي. أصبح التقييم الكمي الأول لكثافات الأصل ومعدلات شوكة النسخ المتماثل في التسلسلات الجينومية الميتازوان ممكنا من خلال التصوير الشعاعي الذاتي لألياف الحمض النووي29.
حاليا ، حلت طرق التصوير الفلوري للألياف محل التصوير الشعاعي الذاتي ، ويرجع ذلك أساسا إلى أن التصوير الفلوري للألياف أسرع بكثير من التصوير الشعاعي الذاتي. في التصوير الفلوري للألياف ، يتم دمج اثنين من مشتقات النوكليوتيدات المهلجنة ، مثل البرومو- (Br) أو الكلورو- (Cl) أو iododeoxyuridine (IdU) ، بالتتابع في الحمض النووي المكرر حديثا ثم يتم تحديدهما عن طريق التألق المناعي غير المباشر باستخدام الأجسام المضادة30. أصبح العرض المجهري للحمض النووي الناشئ الذي دمج أحد النظائر أو كليهما ممكنا عن طريق تلطيخ أحد النظائر بلون واحد والتناظرية الأخرى بلون مختلف (على سبيل المثال ، الحمض النووي الناشئ المناعي مع IdU الأحمر المدمج والأخضر CldU المدمج) (الشكل 1) 21. يمكن التعرف على العديد من الأنواع المختلفة من وسيطة النسخ المتماثل عن طريق تحليل ألياف الحمض النووي. الأكثر شيوعا التي تمت دراستها هي شوكات الاستطالة الفردية ، والبدء ، والإنهاءات. الشوكات الاستطالة الفردية لها نمط تكرار من اللون الأحمر متبوعا باللون الأخضر (أحمر-أخضر; الشكل 2 أ). 13 كثيرا ما تستخدم أطوال هذه المواد الوسيطة لقياس سرعة الشوكة (أي طول الشوكة / وقت النبض) أو التدهور الخارجي للحمض النووي الوليد من خلال تقصير المسار (الشكل 2E) 30،31،32. في دراسة أجراها Mimitou et al. ، وجد أنه عند التعرض طويل الأمد لهيدروكسي يوريا ، وهو سم تكرار يسبب فواصل مزدوجة في الحمض النووي ، تم تجنيد RE1133. MRE11 هو exonuclease معروف بنشاطه exonuclease 3′-5 ، وهو قادر على قطع نهايات الحمض النووي للإصلاح. لذلك ، عند التعرض للعوامل السامة ، يمكن للمرء أن يلاحظ تدهور التحلل الخارجي للحمض النووي الوليد ، وهو تقصير شريط الحمض النووي بسبب التعرض لعامل مدمر للحمض النووي34.
قد تؤدي كسور شوكة النسخ المتماثل الناتجة عن العوائق الفيزيائية (معقدات بروتين الحمض النووي أو آفات الحمض النووي) أو العوائق الكيميائية أو الطفرات إلى إيقاف النسخ المتماثل وتتطلب إعادة التركيب المتماثل لإعادة تشغيله. يعرف هذا باسم ضعف تقدم الشوكة. أشارت العديد من التحقيقات في المختبر وفي الجسم الحي إلى أن النسخ قد يمنع ، في بعض الأحيان ، تقدم شوكة النسخ المتماثل بهذه الطريقة35.
البدايات هي أصول النسخ المتماثل التي تبدأ وتطلق أثناء النبضة الأولى أو الثانية. الأصول التي تطلق أثناء النبضة الأولى ولها شوكات تكرار تستمر في النشاط لها نمط أخضر-أحمر-أخضر (الشكل 2B ، أقل). الأصول التي تبدأ خلال النبضة الثانية لها نمط أخضر فقط (الشكل 2B ، العلوي) وتسمى أحيانا الأصول التي بدأت حديثا ، لذلك يمكن تمييز هذه الأصول عن تلك التي تبدأ أثناء النبضة الأولى. تسمح مقارنة النسب المئوية النسبية للأصول التي تم إطلاقها حديثا بين حالتين تجريبيتين للمرء بفهم كيفية استجابة الخلية لعامل مدمر للحمض النووي أو وجود أو عدم وجود بروتين. يتم إنشاء الإنهاءات عندما يتم دمج شوكتين متماثلتين من replicons المجاورة ، ويكون لهما نمط أحمر-أخضر-أحمر (الشكل 2D)30.
بناء على الحقائق الموضحة أعلاه ، يعتبر تحليل ألياف الحمض النووي حاليا طريقة مفضلة لدراسة الاختلاف في ديناميكيات تكرار الحمض النووي الناجم عن العوامل السامة مثل المواد النانوية. أصبح لدى الباحثين الآن فهم ومعرفة جيدان لديناميات تكرار الحمض النووي على مستوى الجينوم في حقيقيات النوى ، من الناحيتين الكمية والنوعية ، بسبب اكتشاف هذه التكنولوجيا36. واستنادا إلى متغيرات النتائج، يمكن اعتماد عدة منهجيات. يوضح الشكل 3 بعض الأمثلة على طرق دراسة الاختلافات في تلف الحمض النووي الناجم عن العوامل الخارجية / الجسيمات النانوية. الهدف العام من طريقة تحليل ألياف الحمض النووي الموصوفة في هذه الدراسة هو تحديد كيفية تأثير الجسيمات النانوية على عملية النسخ المتماثل في المختبر وكيف تؤثر بشكل تفاضلي على الأنسجة المختلفة.
نناقش هنا طريقة للمساعدة في تحليل التباين في ديناميكيات تضاعف الحمض النووي في وجود الجسيمات النانوية من خلال فحص ألياف الحمض النووي. يتم وصف الخطوات الحرجة الرئيسية المتضمنة في الفحص القياسي في البروتوكول (الخطوة 2.2.2 والخطوة 3.1.3). يوصى دائما باستخدام منطقة ذات تعرض محدود للضوء العلوي وتدف…
The authors have nothing to disclose.
يقر المؤلفون بالدعم المالي المقدم من مؤسسة Blazer ، وبرنامج التكنولوجيا الحيوية الطبية في العلوم الطبية الحيوية ، و UIC Rockford ، وقسم تعليم العلوم الصحية ، UIC Rockford. يشكر المؤلفون أنانيا سانجينيني وجيمس برادلي على مساهماتهما في المشروع.
24 well plate | Fisher brand | FB012929 | |
Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
Alexa flour 594 goat anti-rabbit | Invitrogen | A11037 | |
Alexa fluor 488 chicken anti-rat | Invitrogen | A21470 | |
Alexa fluor 488 goat anti-chicken | Invitrogen | A11039 | |
Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse | Invitrogen | A11062 | |
BSA | Sigma Aldrich | A2153 | |
CldU | Sigma Aldrich | 50-90-8 | |
Coverslips (22 x 50 mm) | Fisher brand | 12-545-EP | |
EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
Frosted Microscope Slides | Fisher brand | 12-550-11 | |
Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 320331 | |
IdU | Sigma Aldrich | 54-42-2 | |
Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | |
Mouse Anti-BrdU | BD Biosciences | 347580 | |
Phosphate Buffer Saline | Gibco | 10010072 | |
Rat anti-BrdU | Abcam | BU1–75(ICR1) | |
Raw 264.5 macrophage cells | ATCC | TIB-71 | |
SDS | Sigma Aldrich | L3771 | |
Silane-Prep slides | Sigma Aldrich | S4651-72EA | |
Superfrost gold plus slides | Fischer scientific | 22-035813 | |
Tris pH 7.4 | Sigma Aldrich | 77861 | |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |