ナノ粒子によって誘発されるDNA損傷および修復ダイナミクスを調べるためのDNAファイバーアッセイのデモンストレーション
Summary
この方法論は、ナノ粒子の存在下でのDNA複製ダイナミクスの変動の分析に役立ちます。目的の材料の細胞毒性レベルに基づいて、さまざまな方法論を採用できます。さらに、DNAファイバー解析に役立つように画像解析の説明が提供される。
Abstract
ナノ材料への曝露は、細胞内の複製ストレスとゲノム不安定性を引き起こす可能性があります。不安定性の程度は、ナノ材料の化学的性質、サイズ、濃度、曝露時間、および曝露された細胞の種類によって異なります。内因性/外因性のエージェントがグローバル複製にどのように影響するかを解明するために、いくつかの確立された方法が使用されてきました。ただし、DNAファイバーアッセイなどのレプリコンレベルのアッセイは、これらの薬剤が複製の開始、終了、および複製フォークの進行にどのように影響するかを理解するために不可欠です。これを知ることで、ナノ材料が突然変異の固定とゲノム不安定性の可能性をどのように高めるかをよりよく理解することができます。RAW 264.7マクロファージをモデル細胞として使用し、酸化グラフェンナノ粒子曝露下での複製ダイナミクスを研究しました。ここでは、ヌクレオチド類似体によるパルス標識、細胞溶解、パルス標識DNAファイバーのスライドへの拡散、DNAファイバー内のヌクレオチドアナログの蛍光免疫染色、共焦点顕微鏡を使用したDNAファイバー内の複製中間体のイメージング、およびコンピューター支援スコアリングおよび分析(CASA)ソフトウェアを使用した複製中間体分析を含む、DNAファイバーアッセイの基本プロトコルを示します。
Introduction
各細胞周期において、DNA複製により正確なゲノム複製が保証されます1。真核生物の染色体複製は、基本的に、複数の複製起点の発火のタイミング、発火した起点から出てくるフォークの速度、および隣接する起点からの2つの複製分岐が2を満たしたときの複製プロセスの終了の3つの要因に依存します。娘細胞への遺伝情報の忠実度の高い伝達と遺伝的完全性の維持には、正確なDNA複製が不可欠です。定期的な代謝から発生する、または人工または天然の環境材料に起因する薬剤は、絶えずゲノムを攻撃しています。これらの内因性および外因性の薬剤は、これらの薬剤によって引き起こされるDNA損傷に遭遇するために複製フォークを減速または停止させ、これらの困難に応じてフォークが一時的に減速または停止することは複製ストレスと呼ばれます3。複製ストレスに応答して、細胞は、乱された複製フォークの安定性を維持し、それらが再開することを可能にするいくつかの分子経路を発達させた4。遺伝的安定性、細胞生存、およびヒト疾患の観点から、これらの複製ストレス応答メカニズムは、健康なゲノムを維持し、細胞の生存を確保し、疾患形成の可能性を減らすための重要な要因として浮上しています5。
複製ストレスを生じさせることができる外因性薬剤の1つはナノ粒子である。ナノ粒子は、サイズが1nmから100nmの範囲の粒子である6。ナノ粒子は、その高い表面積、独特の形状、および独自の化学的特性により、さまざまな医療、製薬、環境、および産業用途で利用されています7,8。ナノ粒子には多くの潜在的な利点がありますが、それらのいくつかは(それらの遺伝性または寿命のために)有毒になる可能性があります。ナノ粒子はまた、医療用インプラントの自然な摩耗および裂け目のために形成され、人工関節周囲領域に放出され得る9、10。
さまざまな用途のために製造された無数のナノ粒子に人間がさらされているため、ナノ粒子毒性の分野の研究は過去10年間で大幅に増加しています11。これらの研究努力により、ナノ粒子が人間の健康にもたらす潜在的な脅威に関する情報が豊富に明らかになりましたが、ナノ粒子が遺伝毒性を引き起こす可能性についての知識はまだ限られています。これまでに発見されたことは、これらのナノ粒子がDNAと物理的に相互作用し、DNA損傷を促進し、DNAの修復または複製に関与するタンパク質を損傷または妨害する可能性があることです12。それらがDNA複製をどのように妨害するかを検出するために、DNAファイバーコーミング、耐放射線性DNA合成(RDS)、およびDNAファイバー分析が通常使用されます13、14、15、16。
DNAファイバーコーミング法は柔軟性があり、単一分子レベルでの複製フォークダイナミクスに関する情報を提供します17。本質的に、塩水化されたカバーガラスは、DNA末端がそれに結合すると、DNA溶液から穏やかに引き出されます。DNA分子は、溶液のメニスカスによってまっすぐに整列されます。DNAファイバーの均質性、間隔、およびアライメントは、正確で信頼性の高いファイバートラクト長の測定をサポートします。治療の長さと順序、およびストレスや損傷を引き起こすために使用される薬物を調整することにより、このアプリケーションを使用してフォークの進歩の多くの側面を監視できます。この方法では、複製フォークの速度と進行が評価される二重ラベリングシステムが使用されます17,18。一方、2Dゲル電気泳動では、アガロースゲル電気泳動では、分岐したDNA構造が同じ質量の線状DNA分子よりもゆっくりと移動するため、2Dランで2つを明確に分離できるという事実を利用しています。実際、この方法は、最初の実行では質量に基づいてDNA分子を分離し、2番目の直交実行では形状に基づいてDNA分子を分離するために調査されています。ゲノムDNA断片化後、珍しい複製および組換え中間体は分岐形態を発達させ、それらは2Dゲル19におけるより一般的な線状分子と区別され得る。
RDS法は、グローバルなDNA合成がどのように影響を受けるかを決定するために使用されます。この方法では、全体的な複製の阻害の程度は、未処理細胞と処理細胞に取り込まれた放射性標識ヌクレオチド、例えば[14C]チミジンの量を比較することによって決定される14,20。未処理細胞と処理細胞の間の放射性標識のパーセンテージ差は、DNA損傷剤がDNA合成に影響を与える程度を表します。これと同様に、別の方法では、フローサイトメトリー用のBrdU(5-ブロモ-2′-デオキシウリジン)などのヌクレオチド類似体を組み込む細胞の能力を使用して、DNA合成の全体的な速度を測定します21,22。これらの方法は、DNA損傷剤がグローバルなDNA合成にどのように影響するかを示していますが、個々のレプリコンがどのように影響を受けるかは示していません。実際、レプリコンレベルのアッセイは、有毒粒子(ナノ材料)曝露の場合のゲノム不安定性の開始と程度をよりよく理解するために不可欠です。DNAファイバーオートラジオグラフィーおよび電子顕微鏡法は、これを決定するために使用されるいくつかの方法である23、24、25、26。
不均等な間隔のソースからの複製気泡と双方向複製の概念は、電子顕微鏡やDNAファイバーオートラジオグラフィーなどの単一分子テストを使用して最初に開発されました27,28。炭素被覆グリッド上に分散した特定の分子上の分岐複製中間体の直接観察は、電子顕微鏡法によって非常に容易になります。この方法は、複製フォークでの病理学的変化を追跡するために今日でも使用されており、DNA複製の最初の真核生物起源を特定するために利用されました28。ファイバーオートラジオグラフィーは、新たに複製された領域のオートラジオグラフィー識別と、トリチウム化チミジンによる染色体のパルスタグ付けの概念を中心としています。後生動物のゲノム配列における起源密度と複製フォーク率の最初の定量的評価は、DNAファイバーオートラジオグラフィーによって可能になりました29。
現在、主にファイバー蛍光透視法がオートラジオグラフィーよりもはるかに高速であるため、ファイバー蛍光透視法がオートラジオグラフィーに取って代わりました。ファイバー蛍光透視法では、ブロモ-(Br)、クロロ-(Cl)、ヨードデオキシウリジン(IdU)などの2つのハロゲン化ヌクレオチド誘導体を新たに複製されたDNAに順次組み込んでから、抗体30を用いた間接免疫蛍光法によって同定します。一方または両方の類似体を組み込んだ新生DNAの顕微鏡観察は、一方のアナログを一方の色で、もう一方のアナログを異なる色で免疫染色することによって可能になります(たとえば、IdU赤と組み込まれたCldU緑で新生DNAを免疫染色します)(図1)21。多くの異なるタイプの複製中間体をDNAファイバー分析によって同定することができる。最も一般的に研究されているのは、個々の伸長フォーク、開始、および終了です。個々の伸長フォークには、赤とそれに続く緑(赤-緑;図2A)。13これらの中間体の長さは、フォーク速度(すなわち、フォークの長さ/パルス時間)またはトラック短縮による新生DNAの外核分解を測定するために頻繁に使用されます(図2E)30、31、32。Mimitouらの研究では、DNAの二本鎖切断を引き起こす複製毒であるヒドロキシ尿素に長期間さらされると、RE11が採用されたことがわかりました33。MRE11は、3′-5’エキソヌクレアーゼ活性で知られるエキソヌクレアーゼであり、修復のためにDNAの末端を切断することができます。したがって、毒性物質に曝露されると、DNA損傷剤への曝露によるDNA鎖の短縮である新生DNAの外核分解が観察される可能性があります34。
物理的な障害(DNA-タンパク質複合体またはDNA病変)、化学的障害、または突然変異によって引き起こされる複製フォークの破損は、複製を停止し、それを再開するために相同組換えを必要とする可能性があります。これは、フォークの進行障害として知られています。多数の インビトロ および インビボ の調査により、転写が複製フォークの進行をこのように妨げる可能性があることが示されています35。
開始は、1 番目または 2 番目のパルス中に開始および起動するレプリケーションの起点です。最初のパルス中に起動し、レプリケーションフォークがアクティブであり続けるオリジンには、緑-赤-緑のパターンがあります(図2B、下)。2番目のパルス中に開始する起点は緑色のみのパターンを持ち(図2B、上)、新しく開始された起点と呼ばれることもあるため、これらの起点は最初のパルス中に開始する起点と区別できます。2つの実験条件間で新たに発火した起源の相対的な割合を比較することで、細胞がDNA損傷剤にどのように反応するか、またはタンパク質の有無を理解することができます。終了は、隣接するレプリコンからの2つのレプリケーションフォークがマージされ、赤-緑-赤のパターンを持つときに作成されます(図2D)30。
上記の事実に基づいて、DNAファイバー分析は現在、ナノ材料などの毒性物質によって引き起こされるDNA複製動態の変動を研究するための好ましい方法と考えられています。研究者は現在、この技術の発見により、真核生物におけるゲノムワイドDNA複製のダイナミクスについて、定量的および定性的の両方で十分な理解と知識を持っています36。結果変数に基づいて、いくつかの方法論を採用できます。外部薬剤/ナノ粒子によって誘発されるDNA損傷の変動を研究する方法のいくつかの例を 図3に示します。この研究で説明されているDNAファイバー分析法の全体的な目標は、ナノ粒子が in vitroでの 複製プロセスにどのように影響するか、およびナノ粒子がさまざまな組織にどのように影響するかを決定することです。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、DNAファイバーアッセイを通じてナノ粒子の存在下でのDNA複製ダイナミクスの変動の分析を支援する方法について説明します。標準アッセイに関与する主要な重要なステップは、プロトコルに記載されています(ステップ2.2.2およびステップ3.1.3)。スライド内の光誘発DNA切断を防ぎ、再現性を高めるために、頭上の光への露出が制限され、一定の気流のある領域を使用することを常に?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ブレイザー財団、UICロックフォードの生物医科学の医療バイオテクノロジープログラム、およびUICロックフォードの健康科学教育部門からの財政的支援を認めています。著者らは、プロジェクトへの貢献について、アナンヤ・サンギネニとジェームズ・ブラッドリーに感謝します。
Materials
| 24 well plate | Fisher brand | FB012929 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Alexa flour 594 goat anti-rabbit | Invitrogen | A11037 | |
| Alexa fluor 488 chicken anti-rat | Invitrogen | A21470 | |
| Alexa fluor 488 goat anti-chicken | Invitrogen | A11039 | |
| Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse | Invitrogen | A11062 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A2153 | |
| CldU | Sigma Aldrich | 50-90-8 | |
| Coverslips (22 x 50 mm) | Fisher brand | 12-545-EP | |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| Frosted Microscope Slides | Fisher brand | 12-550-11 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 320331 | |
| IdU | Sigma Aldrich | 54-42-2 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | |
| Mouse Anti-BrdU | BD Biosciences | 347580 | |
| Phosphate Buffer Saline | Gibco | 10010072 | |
| Rat anti-BrdU | Abcam | BU1–75(ICR1) | |
| Raw 264.5 macrophage cells | ATCC | TIB-71 | |
| SDS | Sigma Aldrich | L3771 | |
| Silane-Prep slides | Sigma Aldrich | S4651-72EA | |
| Superfrost gold plus slides | Fischer scientific | 22-035813 | |
| Tris pH 7.4 | Sigma Aldrich | 77861 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |
References
- Waga, S., Stillman, B. The DNA replication fork in eukaryotic cells. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 721-751 (1998).
- Gambus, A. Termination of eukaryotic replication forks. DNA Replication. 1042, 163-187 (2017).
- Berti, M., Cortez, D., Lopes, M. The plasticity of DNA replication forks in response to clinically relevant genotoxic stress. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 633-651 (2020).
- Carr, A. M., Lambert, S. Replication stress-induced genome instability: The dark side of replication maintenance by homologous recombination. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4733-4744 (2013).
- Berti, M., Vindigni, A. Replication stress: Getting back on track. Nature Structural and Molecular Biology. 23 (2), 103-109 (2016).
- Montes-Burgos, I., et al. Characterisation of nanoparticle size and state prior to nanotoxicological studies. Journal of Nanoparticle Research. 12 (1), 47-53 (2010).
- Khan, I., Saeed, K., Khan, I. Nanoparticles: Properties, applications and toxicities. Arabian Journal of Chemistry. 12 (7), 908-931 (2019).
- Ealia, S. A. M., Saravanakumar, M. P. A review on the classification, characterisation, synthesis of nanoparticles and their application. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 263 (3), 032019 (2017).
- Bijukumar, D. R., et al. Differential toxicity of processed and non-processed states of CoCrMo degradation products generated from a hip simulator on neural cells. Nanotoxicology. 12 (9), 941-956 (2018).
- Bijukumar, D., Segu, A., Chastain, P., Mathew, M. T. Implant-derived CoCrMo alloy nanoparticle disrupts DNA replication dynamics in neuronal cells. Cell Biology and Toxicology. 37 (6), 833-847 (2021).
- Shekhar, S., et al. Deciphering the pathways for evaluation of nanotoxicity: Stumbling block in nanotechnology. Cleaner Engineering and Technology. 5, 100311 (2021).
- Bhabra, G., et al. Nanoparticles can cause DNA damage across a cellular barrier. Nature Nanotechnology. 4 (12), 876-883 (2009).
- Técher, H., et al. Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
- Chastain, P. D., et al. DNA damage checkpoint responses in the S phase of synchronized diploid human fibroblasts. Photochemistry and Photobiology. 91 (1), 109-116 (2015).
- Frum, R. A., Deb, S., Deb, S. P. Use of the DNA fiber spreading technique to detect the effects of mutant p53 on DNA replication. p53 Protocols. , 147-155 (2013).
- Ord, M. G., Stocken, L. A. Studies in synthesis of deoxyribonucleic acid: Radiobiochemical lesion in animal cells. Nature. 182 (4652), 1787-1788 (1958).
- Moore, G., Sainz, J. J., Jensen, R. B. DNA fiber combing protocol using in-house reagents and coverslips to analyze replication fork dynamics in mammalian cells. STAR Protocols. 3 (2), 101371 (2022).
- Blin, M., et al. Transcription-dependent regulation of replication dynamics modulates genome stability. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 58-66 (2019).
- Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. 2D gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast. DNA Electrophoresis. , 43-59 (2020).
- Painter, R. B. Radioresistant DNA synthesis: An intrinsic feature of ataxia telangiectasia. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 84 (1), 183-190 (1981).
- Aten, J. A., Bakker, P. J. M., Stap, J., Boschman, G. A., Veenhof, C. H. N. DNA double labelling with IdUrd and CldUrd for spatial and temporal analysis of cell proliferation and DNA replication. The Histochemical Journal. 24 (5), 251-259 (1992).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo-and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Huberman, J. A., Riggs, A. D. Autoradiography of chromosomal DNA fibers from Chinese hamster cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 55 (3), 599-606 (1966).
- Ockey, C. H. Differences in replicon behavior between X-irradiation-sensitive L5178Y mouse lymphoma cells and AT fibroblasts using DNA fiber autoradiography. Radiation Research. 94 (2), 427-438 (1983).
- Brayner, R. The toxicological impact of nanoparticles. Nano Today. 3 (1-2), 48-55 (2008).
- Mendez-Bermudez, A., et al. Genome-wide control of heterochromatin replication by the telomere capping protein TRF2. Molecular Cell. 70 (3), 449-461 (2018).
- Vindigni, A., Lopes, M. Combining electron microscopy with single molecule DNA fiber approaches to study DNA replication dynamics. Biophysical Chemistry. 225, 3-9 (2017).
- Herrick, J., Bensimon, A. Single molecule analysis of DNA replication. Biochimie. 81 (8-9), 859-871 (1999).
- Taylor, J. H., Miner, P. Units of DNA replication in mammalian chromosomes. 암 연구학. 28 (9), 1810-1814 (1968).
- Nieminuszczy, J., Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. The DNA fibre technique-tracking helicases at work. Methods. 108, 92-98 (2016).
- Lemaçon, D., et al. MRE11 and EXO1 nucleases degrade reversed forks and elicit MUS81-dependent fork rescue in BRCA2-deficient cells. Nature Communications. 8, 860 (2017).
- Vindigni Lab. Replication Fork Protection. Washington University School of Medicine. , (2020).
- Mimitou, E. P., Symington, L. S. DNA end resection: Many nucleases make light work. DNA Repair. 8 (9), 983-995 (2009).
- Schlacher, K., et al. Double-strand break repair-independent role for BRCA2 in blocking stalled replication fork degradation by MRE11. Cell. 145 (4), 529-542 (2011).
- Prado, F., Aguilera, A. Impairment of replication fork progression mediates RNA polII transcription-associated recombination. The EMBO Journal. 24 (6), 1267-1276 (2005).
- Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: Evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).
- Halliwell, J. A., Gravells, P., Bryant, H. E. DNA fiber assay for the analysis of DNA replication progression in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 54 (1), 115 (2020).
- Wang, Y., et al. Automated DNA fiber tracking and measurement. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 1349-1352 (2011).
- Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. DNA fiber analysis: Mind the gap. Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).
- Técher, H., et al. Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
- Martins, D. J., Tirman, S., Quinet, A., Menck, C. F. Detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the DNA fiber assay. Journal of Visualized Experiments. (180), e63448 (2022).
