用于研究纳米颗粒诱导的DNA损伤和修复动力学的DNA纤维测定的演示
Summary
该方法有助于分析纳米颗粒存在下DNA复制动力学的变化。根据目标材料的细胞毒性水平，可以采用不同的方法。此外，还提供了图像分析的描述，以帮助进行DNA纤维分析。
Abstract
纳米材料暴露会导致细胞中的复制应激和基因组不稳定。不稳定程度取决于纳米材料的化学性质、大小和浓度、暴露时间和暴露的细胞类型。已经使用了几种已建立的方法来阐明内源性/外源性因子如何影响全球复制。然而，复制水平的测定（例如 DNA 纤维测定）对于了解这些药物如何影响复制起始、终止和复制叉进展至关重要。了解这一点可以使人们更好地了解纳米材料如何增加突变固定和基因组不稳定的机会。我们使用RAW 264.7巨噬细胞作为模型细胞来研究氧化石墨烯纳米颗粒暴露下的复制动力学。在这里，我们展示了DNA纤维测定的基本方案，其中包括使用核苷酸类似物进行脉冲标记，细胞裂解，将脉冲标记的DNA纤维铺展到载玻片上，DNA纤维内核苷酸类似物的荧光免疫染色，使用共聚焦显微镜对DNA纤维内的复制中间体进行成像，以及使用计算机辅助评分和分析（CASA）软件进行复制中间体分析。
Introduction
在每个细胞周期中，DNA复制可确保准确的基因组复制1。真核染色体复制主要取决于三个因素：多个复制原点的触发时间，从触发的原点出现的分叉的速度，以及当来自相邻原点的两个复制分叉相遇时复制过程的终止2.为了将遗传信息高保真地传输到子细胞，以及保持遗传完整性，准确的DNA复制至关重要。从正常代谢发展而来的物质或由于人工或自然环境材料而形成的物质不断攻击基因组。这些内源性和外源性因子由于遇到这些代理引起的DNA损伤而导致复制叉减慢或停止，而响应这些困难而暂时减慢或停止的叉称为复制应激3。为了应对复制应激，细胞已经发展出几种分子途径，以维持受干扰的复制叉的稳定性并允许它们重新启动4。在遗传稳定性、细胞存活和人类疾病方面，这些复制应激反应机制已成为维持健康基因组、确保细胞存活和降低疾病形成可能性的关键因素5。
能够产生复制应力的外源性物质之一是纳米颗粒。纳米颗粒是尺寸范围从 1 nm 到 100 nm 的颗粒6.由于其高表面积、独特的形状和独特的化学性质，纳米颗粒被用于各种医疗、制药、环境和工业应用7,8。虽然纳米颗粒有很多潜在的好处，但其中一些（由于其遗传性质或寿命）可能会变得有毒。纳米颗粒也可以由于医疗植入物的自然磨损而形成，并释放到假体周围区域9,10中。
由于人类暴露于为各种应用而生产的无数纳米颗粒中，纳米颗粒毒性领域的研究在过去10年中大大增加11。虽然这些研究工作揭示了有关纳米颗粒对人类健康构成潜在威胁的大量信息，但关于纳米颗粒引起遗传毒性的可能性的知识仍然有限。到目前为止，已经发现的是，这些纳米颗粒可以与DNA物理相互作用，促进DNA损伤，并破坏或干扰负责修复或复制DNA12的蛋白质。为了检测它们如何干扰DNA复制，通常使用DNA纤维梳理，抗辐射DNA合成（RDS）和DNA纤维分析13,14,15,16。
DNA纤维梳理方法是灵活的，并在单分子水平上提供有关复制叉动力学的信息17。从本质上讲，一旦DNA末端与其结合，盐碱化的盖玻片就会从DNA溶液中轻轻取出。DNA分子被溶液的弯月面拉直和排列。DNA纤维的均匀性、间距和排列支持准确可靠的纤维束长度测量。通过调整治疗的长度和顺序以及用于造成压力或损伤的药物，可以使用此应用程序监控叉子前进的许多方面。在这种方法中，使用双标记系统，通过该系统评估复制分叉的速度和进度17,18。另一方面，2D凝胶电泳利用了琼脂糖凝胶电泳中分支DNA结构比相同质量的线性DNA分子行进得更慢的事实，从而允许在2D运行中将两者干净地分离。事实上，对这种方法进行了研究，以在第一次运行中根据它们的质量和在第二次正交运行中基于它们的形状来分离 DNA 分子。在基因组DNA片段化之后，不常见的复制和重组中间体发展出分支形式，并且可以将它们与2D凝胶19中更常见的线性分子区分开来。
RDS方法用于确定全球DNA合成如何受到影响。在该方法中，通过比较未处理细胞与处理细胞中掺入的放射性标记核苷酸（例如[14C]胸苷）的量来确定全局复制的抑制程度14,20。未处理和处理的细胞之间放射性标记的百分比差异代表了DNA损伤剂影响DNA合成的程度。与此类似，另一种方法利用细胞整合核苷酸类似物的能力，如BrdU（5-溴-2′-脱氧尿苷）进行流式细胞术，以测量DNA合成的总体速率21,22。虽然这些方法证明了DNA损伤剂如何影响全球DNA合成，但它们并没有显示单个复制子是如何受到影响的。事实上，重复水平的测定对于更好地了解有毒颗粒（纳米材料）暴露情况下基因组不稳定的起始和程度至关重要。DNA纤维放射自显影和电子显微镜检查是用于确定这一点的一些方法23,24,25,26。
复制气泡和来自不均匀间隔来源的双向复制的概念首先是使用单分子测试（如电子显微镜和DNA纤维放射自显影）开发的27,28。电子显微镜极大地促进了分散在碳涂层网格中的特定分子上分支复制中间体的直接观察。这种方法今天仍在用于跟踪复制叉处的病理变化，用于定位DNA复制的第一个真核起源28。纤维放射自显影以新复制区域的放射自显影鉴定和用氚化胸苷对染色体进行脉冲标记的概念为中心。DNA纤维放射自显影使后生动物基因组序列中的起源密度和复制叉率的首次定量评估成为可能29。
目前，纤维荧光照相方法已经取代了放射自显影，主要是因为纤维荧光照相比放射自显影快得多。在光纤荧光照相术中，将两种卤代核苷酸衍生物，如溴-（Br）、氯-（Cl）或碘脱氧尿苷（IdU））依次掺入新鲜复制的DNA中，然后使用抗体30通过间接免疫荧光鉴定。通过将一种或两种类似物的免疫染色和另一种类似物的不同颜色进行免疫染色（例如，用掺入的 IdU 红和掺入的 CldU 绿对新生 DNA 进行免疫染色）（图 1）21。许多不同类型的复制中间体可以通过DNA纤维分析来鉴定。最常研究的是单个细长叉、启动和终止。单个细长叉具有红色的复制模式，然后是绿色（红绿;图2A）。13这些中间体的长度经常用于测量叉速度（即叉长/脉冲时间）或通过轨迹缩短来测量新生DNA的核苷酸外分解降解（图2E）30,31,32。在Mimitou等人的一项研究中，发现长期暴露于羟基脲（一种导致DNA双链断裂的复制毒药）后，RE11被招募33。MRE11是一种核酸外切酶，以其3′-5’核酸外切酶活性而闻名，它能够切割DNA末端进行修复。因此，当暴露于有毒物质时，人们可能会观察到新生DNA的核苷外分解降解，这是由于暴露于DNA损伤剂而导致的DNA链缩短34。
由物理障碍（DNA-蛋白质复合物或DNA损伤）、化学障碍或突变引起的复制叉断裂可能会停止复制，需要同源重组才能重新启动复制。这被称为分叉进展受损。许多 体外 和 体内 研究表明，转录有时可能会以这种方式阻止复制叉的进步35。
启动是在第一个或第二个脉冲期间启动和触发的复制源。在第一个脉冲期间触发并具有继续处于活动状态的复制分叉的起源具有绿-红-绿模式（图2B，下图）。在第二个脉冲期间启动的起源具有仅绿色模式（图2B，上图），有时称为新启动的起源，因此这些起源可以与在第一个脉冲期间启动的起源区分开来。比较两种实验条件之间新烧制起源的相对百分比，可以了解细胞如何对DNA损伤剂或蛋白质的存在与否做出反应。当来自相邻复制子的两个复制分支合并时，将创建终止，并且它们具有红-绿-红模式（图 2D）30。
基于上述事实，DNA纤维分析目前被认为是研究由纳米材料等有毒物质引起的DNA复制动力学变化的首选方法。由于这项技术的发现，研究人员现在对真核生物中全基因组DNA复制的动态有了很好的理解和了解，无论是定量还是定性36。根据结果变量，可以采用几种方法。 图3显示了研究由外部试剂/纳米颗粒诱导的DNA损伤变化的一些方法示例。本研究中描述的DNA纤维分析方法的总体目标是确定纳米颗粒如何影响 体外 复制过程以及它们如何差异化地影响各种组织。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们在这里讨论一种方法，以帮助通过DNA纤维测定分析在纳米颗粒存在下DNA复制动力学的变化。标准测定中涉及的主要关键步骤在协议中描述（步骤2.2.2和步骤3.1.3）。始终建议使用顶部光暴露有限且气流恒定的区域，以防止载玻片中光诱导的DNA断裂并提高可重复性。需要特别注意载玻片上细胞裂解物干燥的持续时间。过度干燥会对纤维扩散产生负面影响。第二个关键步骤是使用酸溶液使纤维变性…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢Blazer基金会，生物医学科学医学生物技术计划，UIC Rockford和UIC Rockford健康科学教育系的财政支持。作者感谢Ananya Sangineni和James Bradley对该项目的贡献。
Materials
| 24 well plate | Fisher brand | FB012929 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Alexa flour 594 goat anti-rabbit | Invitrogen | A11037 | |
| Alexa fluor 488 chicken anti-rat | Invitrogen | A21470 | |
| Alexa fluor 488 goat anti-chicken | Invitrogen | A11039 | |
| Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse | Invitrogen | A11062 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A2153 | |
| CldU | Sigma Aldrich | 50-90-8 | |
| Coverslips (22 x 50 mm) | Fisher brand | 12-545-EP | |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| Frosted Microscope Slides | Fisher brand | 12-550-11 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 320331 | |
| IdU | Sigma Aldrich | 54-42-2 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | |
| Mouse Anti-BrdU | BD Biosciences | 347580 | |
| Phosphate Buffer Saline | Gibco | 10010072 | |
| Rat anti-BrdU | Abcam | BU1–75(ICR1) | |
| Raw 264.5 macrophage cells | ATCC | TIB-71 | |
| SDS | Sigma Aldrich | L3771 | |
| Silane-Prep slides | Sigma Aldrich | S4651-72EA | |
| Superfrost gold plus slides | Fischer scientific | 22-035813 | |
| Tris pH 7.4 | Sigma Aldrich | 77861 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |
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