Modifiye Otolog Şartlandırılmış Serum Üretimi ve Murin Kornea Epitelinde İyileşme Potansiyelinin Ex Vivo Değerlendirilmesi
Summary
Bu makalede, süreci basitleştirmek ve otolog şartlandırılmış serum (AKS) hazırlanmasını daha ucuz hale getirmek için bir protokol açıklanmaktadır. Özel şırıngalara veya yüzey kaplamalı cam boncuklara gerek yoktur. Ayrıca, modifiye ACS (mACS), murin gözlerin ex vivo kornea yara iyileşmesinde konvansiyonel otolog seruma göre rekabet avantajına sahiptir.
Abstract
İnsan kanından türetilen topikal tedaviler son yıllarda klinisyenler için bir nimet olmuştur. Otolog serum (AS) ve trombositten zengin plazma (PRP), kornea yara iyileşmesinde önemli olan epitelyotropik büyüme faktörleri açısından zenginleştirilmiştir. AS’den farklı olarak PRP, daha fazla trombosit kaynaklı büyüme faktörü sağlayan diferansiyel bir santrifüjleme sistemine dayanır. Otolog şartlandırılmış serum (AKS) sadece AS ve PRP’nin hazırlanmasını korumakla kalmaz, aynı zamanda enflamatuar hastalıklarda önemli olan bağışıklık modüle edici özelliklere de odaklanır.
Standartlaştırılmış protokollerin eksikliği ve yüksek hazırlık maliyetleri, AKS’nin klinik uygulaması için sınırlamalardır. Bu video deneyi, modifiye otolog koşullu serum (mACS) göz damlası hazırlamak için standart bir çalışma prosedürünü göstermektedir. İlk olarak, hipoksik inkübasyon sırasında kan hücresi stabilizatörü olarak heparin şırıngalarına gliserol eklendi. Kan hücrelerini aktive etmek için, 37 ° C’de 4 saatlik bir inkübasyon başlatıldı. Daha sonra, kan örnekleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 3.500 × g’da santrifüj edildi. Süpernatantın 0.22 μm’lik bir filtreden filtrelenmesinden sonra, mACS göz damlaları tamamen hazırlandı.
mACS’nin terapötik etkisinin geçici bir denemesi, ex vivo fare gözlerinde kornea yara iyileşmesinde geleneksel AS’ye göre rekabet avantajlarına sahip olabileceğini göstermiştir. Bu çalışmada kullanılan AS, yayınlanan çalışmalara ve hastanemizdeki klinik uygulamaya göre hazırlanmıştır. Bu nedenle, mACS’nin oküler yüzey hastalıkları üzerindeki etkinliği, in vivo hayvan çalışmaları ve klinik çalışmalar yoluyla gelecekteki araştırmalarda değerlendirilebilir.
Introduction
Kuru göz hastalıklarında otolog serumun (AS) terapötik etkileri ilk olarak 1980’lerde Fox ve ark.1 tarafından bildirilmiştir. Hem yağlama özelliğinin hem de AS’deki doğal gözyaşlarını taklit eden temel epitelyotropik biyokimyasal bileşenlerin kornea epitel hücrelerinin çoğalmasına fayda sağladığına inanılmaktadır. Geçtiğimiz on yıllar boyunca, bu temelde çeşitli çalışmalar yapılmıştır. Trofik bileşenler epidermal büyüme faktörü (EGF), A vitamini, dönüştürücü büyüme faktörü β (TGF-β) ve diğer sitokinleri içerir. İlginç bir şekilde, serum, epidermal proliferasyonda önemli bir rol oynadığına inanılan TGF- β ve A vitamini bakımından zengindir 2,3,4,5. Ek olarak, oküler yüzey hastalıkları olan hastaları tedavi ederken, çeşitli çalışmalar AS göz damlalarının hasta tarafından bildirilen sonuçlarda, diğer objektif kuru göz parametrelerinde 6,7 ve hücre yoğunluğu8 gibi mikroskobik bulgularda bazı avantajları olduğunu göstermiştir. Meta-analiz çalışmaları, AS göz damlası tedavisi ile hasta sendromlarının iyileştirilmesinde bazı faydalar olabileceğini ortaya koymuştur, ancak uzun vadeli sonuçlar ve gözlemler hala 9,10’dan yoksundur.
AS’den farklı olarak, trombositten zengin plazma (PRP), trombositlerin daha fazla diferansiyel santrifüjlenmesi ve kimyasal aktivasyonu ile hazırlık sırasında bir antikoagülan eklenmesinden elde edilir. AS ile karşılaştırıldığında, PRP’de TGF-β, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ve EGF gibi çok sayıda kimyasal madde ve büyüme faktörü mevcuttur. Ayrıca semptom hafifletmede klinik yararları olan oküler yüzey hastalıklarına da uygulanmıştır11.
Epitel defektleri ve inflamasyon arasındaki çapraz bağlantı karmaşıktır. Özellikle immünopatofizyoloji oküler yüzey hastalıklarında bir diğer önemli konudur. IL-1β ve IFN-γ gibi pro-inflamatuar sitokinlerin, inflamatuar kaskadlar12’de pivotal mediatörler olduğuna inanılmaktadır. Böylece bağışıklık mekanizmasının anlaşılmasına dayalı yeni tedavi yolları açılır. İnterlökin-1 reseptör antagonisti (IL-1Ra) ve diğer anti-enflamatuar sitokinlerin üretimi de dahil olmak üzere bu enflamatuar süreci durdurma stratejileri de oküler yüzey hastalıklarında önemli bir rol oynayabilir13,14,15.
1998 yılından bu yana, ticarileştirilmiş otolog şartlandırılmış serum (AKS) olan Orthokin, osteoartrit (OA), romatoid artrit (RA) ve omurga rahatsızlıklarından muzdarip ortopedik hastalarda klinik olarak kullanılmaktadır13. AS ve PRP ile karşılaştırıldığında, kimyasal olarak kaplanmış cam boncuklarla muamele ve monositleri aktive etmek için hipoksik inkübasyon ACS16’nın spesifik özellikleridir. Teorik olarak, hücrelere hayatta kalma stresi eklenerek daha fazla anti-enflamatuar faktör salgılanabilir, bu da IL-1Ra dahil olmak üzere esansiyel bağışıklık modüle edici bileşenlerin daha yüksek konsantrasyonuna neden olur. OA’da AKS’nin AS ile karşılaştırıldığında geliştirilmiş terapötik yararları da bildirilmiştir17. Oküler yüzey hastalıkları, bazı açılardan ortopedik inflamatuar hastalıklarla benzer bağışıklık geçmişlerini paylaşır. Bu nedenle, ortopedik alanda insan kanından türetilmiş tedavinin başarılı sonuçlarına dayanarak, AKS’nin epitelyotropik ve immün modüle edici özellikleri ile klinik pratikte konvansiyonel tedavilere göre avantajları olabilir. AKS, ortopedik inflamatuar hastalıklarda yaygın olarak kullanılmasına rağmen, oftalmolojideki klinik uygulamalarının hala araştırılması gerekmektedir, bu da yüksek maliyeti, literatür desteğinin eksikliği ve hazırlık sürecinin standardizasyonunun olmaması nedeniyle engellenebilir ve bu da farklı performanslara neden olabilir.
Bu video makalesinde, modifiye ACS’yi (mACS) veya büyüme faktörleri bakımından zengin plazmayı (PRGF) üretmek için yeni, uygun maliyetli ve kullanışlı bir yöntem gösterildi ve ticarileştirilmiş ACS’lerle karşılaştırılabilir pratik değere sahip bir göz damlası çözeltisi üretildi. Antikoagülanların eklenmesi ve kan hücrelerinin stresli inkübasyon yoluyla anti-enflamatuar sitokinler salgılaması için tetiklenmesi konusundaki temel fikirler korunmuştur, ancak CrSO4 kaplı cam boncuklara ve ticari kitlere dayananlar gibi kimyasal olarak indüklenen yöntemlerin aksine, kritik stres durumu bu yöntemde hipoksik inkübasyon tarafından fiziksel olarak indüklenir. Ayrıca, kan hücrelerinin zarının stabilitesinde bir artış, uygun bir ozmotik hücre dışı sıvı basıncınınkorunması 18 ve hipoksik koşullarda hücreleri aşırı strese sokmaktan kaçınan uygun bir besin kaynağı da dahil olmak üzere ekstra faydalar sağlamak için gliserol eklenmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, mACS’nin hazırlanması için bir protokol tarif edilmiş ve mACS göz damlalarının hayvan modellerinin yara iyileşmesindeki yararı daha da gösterilmiştir. Bu mACS protokolünün en önemli modifikasyonu, her test tüpüne yaklaşık 0.5 mL% 10 gliserol çözeltisinin eklenmesidir ve bu da 37 ° C’de 4 saatlik inkübasyon sırasında uygun hipoksik koşullar yaratır. Bu ayar, AS’ye uygun stres sağlar ve hücreleri yara iyileşmesine yardımcı olan gerekli büyüme faktörlerini salgılamaya te?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, mükemmel teknik yardım için Ya-Lan Chien ve Chia-Ying Lee’ye ve dilbilimsel baskı için OnLine English şirketine teşekkür eder. Bu çalışma kısmen Chang Gung Tıbbi Araştırma Projesi (Hibe No. CMRPG3L1491) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| 96-well culture plate | Merck KGaA, Germany | CLS3997 | |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units | Becton,Dickinson and Company, US | 367880 | At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination |
| BD 21 G butterfly-winged infusion set | Becton,Dickinson and Company, US | 367281 | For even distribution of glycerol solution |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | for mouse model |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5811000428 | 3,500 x g for 10 min |
| Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle | Cheng Yi Chemical, Taiwan | CP405141 | Must be sterile and as the storage container for the final product |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Dulbecco's modified minimal essential medium | Merck KGaA, Germany | D6429 | |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Incubator | Firstek, Taiwan | S300S | 37 °C for 4 h |
| Kanam sterile gloves | Kanam Latex Industries, India | EN455 | For aseptic operation |
| Merck 0.22 µm filter | Merck KGaA, Germany | PR05359 | At least 2 filters for mACS filtration |
| Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution | Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan | 19496 | To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Terumo 18 G needle | Terumo, Taiwan | SMACF0120-18BX | 3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation |
| Terumo 20.0 mL syringe | Terumo, Taiwan | MDSS20ES | Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation. |
| Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle | Terumo, Taiwan | MDSS03S2325 | 3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles. |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 |
References
- Fox, R. I., Chan, R., Michelson, J. B., Belmont, J. B., Michelson, P. E. Beneficial effect of artificial tears made with autologous serum in patients with keratoconjunctivitis sicca. Arthritis and Rheumatology. 27 (4), 459-461 (1984).
- Noble, B. A., et al. Comparison of autologous serum eye drops with conventional therapy in a randomised controlled crossover trial for ocular surface disease. The British Journal of Ophthalmology. 88 (5), 647-652 (2004).
- Bradley, J. C., Bradley, R. H., McCartney, D. L., Mannis, M. J. Serum growth factor analysis in dry eye syndrome. Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (8), 717-720 (2008).
- Alshammari, T. M., Al-Hassan, A. A., Hadda, T. B., Aljofan, M. Comparison of different serum sample extraction methods and their suitability for mass spectrometry analysis. Saudi Pharmaceutical Journal. 23 (6), 689-697 (2015).
- Tsubota, K., et al. Treatment of dry eye by autologous serum application in Sjögren’s syndrome. The British Journal of Ophthalmology. 83 (4), 390-395 (1999).
- Urzua, C. A., Vasquez, D. H., Huidobro, A., Hernandez, H., Alfaro, J. Randomized double-blind clinical trial of autologous serum versus artificial tears in dry eye syndrome. Current Eye Research. 37 (8), 684-688 (2012).
- Cui, D., Li, G., Akpek, E. K. Autologous serum eye drops for ocular surface disorders. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 21 (5), 493-499 (2021).
- Jirsova, K., et al. The application of autologous serum eye drops in severe dry eye patients; subjective and objective parameters before and after treatment. Current Eye Research. 39 (1), 21-30 (2014).
- Pan, Q., Angelina, A., Marrone, M., Stark, W. J., Akpek, E. K. Autologous serum eye drops for dry eye. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2 (2), (2017).
- Wang, L., et al. Autologous serum eye drops versus artificial tear drops for dry eye disease: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Ophthalmic Research. 63 (5), 443-451 (2020).
- Soni, N. G., Jeng, B. H. Blood-derived topical therapy for ocular surface diseases. The British Journal of Ophthalmology. 100 (1), 22-27 (2016).
- Solomon, A., et al. anti-inflammatory forms of interleukin-1 in the tear fluid and conjunctiva of patients with dry-eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 42 (10), 2283-2292 (2001).
- Meijer, H., Reinecke, J., Becker, C., Tholen, G., Wehling, P. The production of anti-inflammatory cytokines in whole blood by physico-chemical induction. Inflammation Research. 52 (10), 404-407 (2003).
- Bielory, B. P., Shah, S. P., O’Brien, T. P., Perez, V. L., Bielory, L. Emerging therapeutics for ocular surface disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (5), 477-486 (2016).
- Stevenson, W., Chauhan, S. K., Dana, R. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).
- Yang, J., Guo, A., Li, Q., Wu, J. Platelet-rich plasma attenuates interleukin-1β-induced apoptosis and inflammation in chondrocytes through targeting hypoxia-inducible factor-2α. Tissue and Cell. 73, 101646 (2021).
- Shakouri, S. K., Dolati, S., Santhakumar, J., Thakor, A. S., Yarani, R. Autologous conditioned serum for degenerative diseases and prospects. Growth Factors. 39 (1-6), 59-70 (2021).
- Gull, M., Pasek, M. A. The role of glycerol and its derivatives in the biochemistry of living organisms, and their prebiotic origin and significance in the evolution of life. Catalysts. 11 (1), 86 (2021).
- Drew, V. J., Tseng, C. L., Seghatchian, J., Burnouf, T. Reflections on dry eye syndrome treatment: therapeutic role of blood products. Frontiers in Medicine. 5, 33 (2018).
- Hung, K. H., Yeh, L. K. Ex vivo and in vivo animal models for mechanical and chemical injuries of corneal epithelium. Journal of Visualized Experiments. (182), e63217 (2022).
- Geerling, G., Maclennan, S., Hartwig, D. Autologous serum eye drops for ocular surface disorders. The British Journal of Ophthalmology. 88 (11), 1467-1474 (2004).
- Rutgers, M., Saris, D. B., Dhert, W. J., Creemers, L. B. Cytokine profile of autologous conditioned serum for treatment of osteoarthritis, in vitro effects on cartilage metabolism and intra-articular levels after injection. Arthritis Research & Therapy. 12 (3), R114 (2010).
- Antebi, B., et al. Short-term physiological hypoxia potentiates the therapeutic function of mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 265 (2018).
- Chen, Y. M., Wang, W. Y., Lin, Y. C., Tsai, S. H., Lou, Y. T. Use of autologous serum eye drops with contact lenses in the treatment of chemical burn-induced bilateral corneal persistent epithelial defects. BioMed Research International. 2022, 6600788 (2022).
- Diaz-Valle, D., et al. Comparison of the efficacy of topical insulin with autologous serum eye drops in persistent epithelial defects of the cornea. Acta Ophthalmologica. 100 (4), e912-e919 (2022).
- Metheetrairut, C., et al. Comparison of epitheliotrophic factors in platelet-rich plasma versus autologous serum and their treatment efficacy in dry eye disease. Scientific Reports. 12 (1), 8906 (2022).
- NaPier, E., Camacho, M., McDevitt, T. F., Sweeney, A. R. Neurotrophic keratopathy: current challenges and future prospects. Annals of Medicine. 54 (1), 666-673 (2022).
- Garcia-Conca, V., et al. Efficacy and safety of treatment of hyposecretory dry eye with platelet-rich plasma. Acta Ophthalmologica. 97 (2), e170-e178 (2019).
- Gholian, S., et al. Use of autologous conditioned serum dressings in hard-to-heal wounds: a randomised prospective clinical trial. Journal of Wound Care. 31 (1), 68-77 (2022).
- Raeissadat, S. A., Rayegani, S. M., Jafarian, N., Heidari, M. Autologous conditioned serum applications in the treatment of musculoskeletal diseases: a narrative review. Future Science OA. 8 (2), 776 (2022).
- Tokawa, P. K. A., Brossi, P. M., Baccarin, R. Y. A. Autologous conditioned serum in equine and human orthopedic therapy: A systematic review. Research in Veterinary Science. 146, 34-52 (2022).
- Evans, C. H., Chevalier, X., Wehling, P. Autologous conditioned serum. Physical Medicine and Rehabilitation. Clinics of North America. 27 (4), 893-908 (2016).
- Coskun, H. S., Yurtbay, A., Say, F. Platelet rich plasma versus autologous conditioned serum in osteoarthritis of the knee: clinical results of a five-year retrospective study. Cureus. 14 (4), e24500 (2022).
