Denne artikel beskriver en protokol, der skal forenkle processen og gøre fremstillingen af autologt konditioneret serum (ACS) billigere. Der kræves ingen specielle sprøjter eller overfladebelagte glasperler. Desuden har den modificerede ACS (mACS) konkurrencemæssige fordele i forhold til konventionelt autologt serum i hornhindesårheling af murine øjne ex vivo.
Topiske terapier afledt af humant blod har været en velsignelse for klinikere i de seneste årtier. Autologt serum (AS) og blodpladerigt plasma (PRP) er beriget med epitheliotropiske vækstfaktorer, der er afgørende for hornhindesårheling. I modsætning til AS er PRP baseret på et differentielt centrifugeringssystem, hvilket giver flere blodpladeafledte vækstfaktorer. Autologt konditioneret serum (ACS) bevarer ikke kun fremstillingen af AS og PRP, men fokuserer også på immunmodulerende egenskaber, som er vigtige i inflammatoriske sygdomme.
Manglen på standardiserede protokoller og høje forberedelsesomkostninger er begrænsninger for den kliniske anvendelse af ACS. Dette videoeksperiment demonstrerer en standardprocedure til fremstilling af modificerede autologe konditionerede serumøjendråber (mACS). Først blev glycerol tilsat i heparinsprøjter som blodcellestabilisator under hypoxisk inkubation. For at aktivere blodcellerne blev en 4 timers inkubation ved 37 °C initieret. Derefter blev blodprøverne centrifugeret ved 3.500 × g i 10 minutter ved stuetemperatur. Efter filtrering af supernatanten gennem et 0,22 μm filter var mACS øjendråberne fuldt klargjort.
En foreløbig afprøvning af den terapeutiske virkning af mACS viste, at det kan have konkurrencemæssige fordele i forhold til konventionel AS i hornhindesårheling i ex vivo museøjne. Den AS, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev udarbejdet i henhold til offentliggjorte undersøgelser og den kliniske praksis på vores hospital. Derfor kan effekten af mACS på øjenoverfladesygdomme evalueres i fremtidig forskning gennem in vivo dyreforsøg og kliniske forsøg.
De terapeutiske virkninger af autologt serum (AS) i tørre øjensygdomme blev først rapporteret i 1980’erne af Fox et al.1. Det antages, at både smøreegenskaben og de essentielle epitheliotropiske biokemiske komponenter i AS, der efterligner naturlige tårer, gavner spredningen af hornhindepitelceller. I løbet af de sidste årtier er der udført flere undersøgelser på dette grundlag. Trofiske komponenter omfatter epidermal vækstfaktor (EGF), vitamin A, transformerende vækstfaktor β (TGF-β) og andre cytokiner. Interessant nok er serumet rig på TGF-β og vitamin A, som menes at spille en afgørende rolle i epidermal proliferation 2,3,4,5. Derudover har flere undersøgelser ved behandling af patienter med okulære overfladesygdomme vist nogle fordele ved AS-øjendråber i patientrapporterede resultater, andre objektive tørre øjenparametre 6,7 og mikroskopiske fund såsom celletæthed8. Metaanalyseundersøgelser viste, at der kan være nogle fordele ved at forbedre patientens syndromer med AS-øjendråberbehandling, men langsigtede resultater og observationer mangler stadig 9,10.
I modsætning til AS er blodpladerig plasma (PRP) afledt af tilsætning af et antikoagulant under fremstillingen med yderligere differentiel centrifugering og kemisk aktivering af blodpladerne. Sammenlignet med AS er der adskillige kemikalier og vækstfaktorer, såsom TGF-β, vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) og EGF, til stede i PRP. Det er også blevet anvendt på okulære overfladesygdomme med kliniske fordele i symptomlindring11.
Tværforbindelsen mellem epiteldefekter og betændelse er kompleks. Især immunopatofysiologi er et andet vigtigt spørgsmål i okulære overfladesygdomme. Proinflammatoriske cytokiner, såsom IL-1β og IFN-γ, menes at være afgørende mediatorer i inflammatoriske kaskader12. Nye behandlingsveje åbnes således baseret på forståelse af immunmekanismen. Strategier til at stoppe denne inflammatoriske proces, herunder produktion af interleukin-1-receptorantagonist (IL-1Ra) og andre antiinflammatoriske cytokiner, kan også spille en vigtig rolle i okulære overfladesygdomme13,14,15.
Siden 1998 er ortokin, et kommercialiseret autologt konditioneret serum (ACS), blevet anvendt klinisk hos ortopædiske patienter, der lider af slidgigt (OA), reumatoid arthritis (RA) og rygsygdomme13. Sammenlignet med AS og PRP er behandling med kemisk overtrukne glasperler og hypoxisk inkubation for at aktivere monocytter de specifikke træk ved ACS16. Teoretisk set kan flere antiinflammatoriske faktorer udskilles ved at tilføje overlevelsesstress til cellerne, hvilket resulterer i en højere koncentration af essentielle immunmodulerende komponenter, herunder IL-1Ra. De forbedrede terapeutiske fordele ved ACS i OA sammenlignet med AS er også blevet rapporteret17. Okulære overfladesygdomme deler lignende immun baggrund med ortopædiske inflammatoriske sygdomme i nogle henseender. Baseret på de vellykkede resultater af human blodafledt terapi på det ortopædiske område kan ACS derfor have fordele i forhold til konventionelle behandlinger i klinisk praksis ved epitheliotropiske og immunmodulerende egenskaber. Selvom ACS har været meget udbredt i ortopædiske inflammatoriske sygdomme, skal dets kliniske anvendelser inden for oftalmologi stadig undersøges, hvilket kan hindres af dets høje omkostninger, mangel på litteraturstøtte og manglende standardisering af forberedelsesprocessen, hvilket resulterer i forskellig ydeevne.
I denne videoartikel blev en ny, omkostningseffektiv og bekvem metode demonstreret til at generere den modificerede ACS (mACS) eller plasma rig på vækstfaktorer (PRGF), der producerer en øjendråbeopløsning med en sammenlignelig praktisk værdi med kommercialiserede ACS’er. Nøgleideerne om at tilføje antikoagulantia og udløse blodcellerne til at udskille antiinflammatoriske cytokiner ved stresset inkubation blev bibeholdt, men i modsætning til de kemisk inducerede metoder, såsom dem, der er baseret på CrSO 4-coatede glasperler og kommercielle kits, induceres den kritiske stressstatus fysisk ved hypoxisk inkubation i denne metode. Desuden blev glycerol tilsat for at give ekstra fordele, herunder en stigning i stabiliteten af blodkarcellernes membran, vedligeholdelse af et korrekt osmotisk ekstracellulært væsketryk18 og en passende kilde til næringsstoffer under hypoxiske forhold, der undgår overbelastning af cellerne.
I denne undersøgelse beskrives en protokol til fremstilling af mACS, og fordelen ved mACS øjendråber i sårheling af dyremodeller vises yderligere. Den afgørende ændring af denne mACS-protokol er tilsætning af ca. 0,5 ml 10% glycerolopløsning i hvert reagensglas, hvilket skaber passende hypoxiske forhold under 4 timers inkubation ved 37 °C. Denne indstilling giver AS korrekt stress og beder celler om at udskille de nødvendige vækstfaktorer, der hjælper sårheling. 0,22 μm filteret kan hjælpe med at eliminer…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Ya-Lan Chien og Chia-Ying Lee for fremragende teknisk assistance og OnLine English Company for den sproglige udgave. Denne undersøgelse blev delvist finansieret af Chang Gung Medical Research Project (bevillingsnr. CMRPG3L1491).
96-well culture plate | Merck KGaA, Germany | CLS3997 | |
Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units | Becton,Dickinson and Company, US | 367880 | At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination |
BD 21 G butterfly-winged infusion set | Becton,Dickinson and Company, US | 367281 | For even distribution of glycerol solution |
C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | for mouse model |
Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5811000428 | 3,500 x g for 10 min |
Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle | Cheng Yi Chemical, Taiwan | CP405141 | Must be sterile and as the storage container for the final product |
Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
Dulbecco's modified minimal essential medium | Merck KGaA, Germany | D6429 | |
Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
Incubator | Firstek, Taiwan | S300S | 37 °C for 4 h |
Kanam sterile gloves | Kanam Latex Industries, India | EN455 | For aseptic operation |
Merck 0.22 µm filter | Merck KGaA, Germany | PR05359 | At least 2 filters for mACS filtration |
Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution | Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan | 19496 | To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells |
Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
Terumo 18 G needle | Terumo, Taiwan | SMACF0120-18BX | 3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation |
Terumo 20.0 mL syringe | Terumo, Taiwan | MDSS20ES | Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation. |
Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle | Terumo, Taiwan | MDSS03S2325 | 3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles. |
Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 |