Summary

Fremstilling af modificeret autologt konditioneret serum og ex vivo-vurdering af dets helingspotentiale i murinepitel

Published: March 24, 2023
doi:

Summary

Denne artikel beskriver en protokol, der skal forenkle processen og gøre fremstillingen af autologt konditioneret serum (ACS) billigere. Der kræves ingen specielle sprøjter eller overfladebelagte glasperler. Desuden har den modificerede ACS (mACS) konkurrencemæssige fordele i forhold til konventionelt autologt serum i hornhindesårheling af murine øjne ex vivo.

Abstract

Topiske terapier afledt af humant blod har været en velsignelse for klinikere i de seneste årtier. Autologt serum (AS) og blodpladerigt plasma (PRP) er beriget med epitheliotropiske vækstfaktorer, der er afgørende for hornhindesårheling. I modsætning til AS er PRP baseret på et differentielt centrifugeringssystem, hvilket giver flere blodpladeafledte vækstfaktorer. Autologt konditioneret serum (ACS) bevarer ikke kun fremstillingen af AS og PRP, men fokuserer også på immunmodulerende egenskaber, som er vigtige i inflammatoriske sygdomme.

Manglen på standardiserede protokoller og høje forberedelsesomkostninger er begrænsninger for den kliniske anvendelse af ACS. Dette videoeksperiment demonstrerer en standardprocedure til fremstilling af modificerede autologe konditionerede serumøjendråber (mACS). Først blev glycerol tilsat i heparinsprøjter som blodcellestabilisator under hypoxisk inkubation. For at aktivere blodcellerne blev en 4 timers inkubation ved 37 °C initieret. Derefter blev blodprøverne centrifugeret ved 3.500 × g i 10 minutter ved stuetemperatur. Efter filtrering af supernatanten gennem et 0,22 μm filter var mACS øjendråberne fuldt klargjort.

En foreløbig afprøvning af den terapeutiske virkning af mACS viste, at det kan have konkurrencemæssige fordele i forhold til konventionel AS i hornhindesårheling i ex vivo museøjne. Den AS, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev udarbejdet i henhold til offentliggjorte undersøgelser og den kliniske praksis på vores hospital. Derfor kan effekten af mACS på øjenoverfladesygdomme evalueres i fremtidig forskning gennem in vivo dyreforsøg og kliniske forsøg.

Introduction

De terapeutiske virkninger af autologt serum (AS) i tørre øjensygdomme blev først rapporteret i 1980’erne af Fox et al.1. Det antages, at både smøreegenskaben og de essentielle epitheliotropiske biokemiske komponenter i AS, der efterligner naturlige tårer, gavner spredningen af hornhindepitelceller. I løbet af de sidste årtier er der udført flere undersøgelser på dette grundlag. Trofiske komponenter omfatter epidermal vækstfaktor (EGF), vitamin A, transformerende vækstfaktor β (TGF-β) og andre cytokiner. Interessant nok er serumet rig på TGF-β og vitamin A, som menes at spille en afgørende rolle i epidermal proliferation 2,3,4,5. Derudover har flere undersøgelser ved behandling af patienter med okulære overfladesygdomme vist nogle fordele ved AS-øjendråber i patientrapporterede resultater, andre objektive tørre øjenparametre 6,7 og mikroskopiske fund såsom celletæthed8. Metaanalyseundersøgelser viste, at der kan være nogle fordele ved at forbedre patientens syndromer med AS-øjendråberbehandling, men langsigtede resultater og observationer mangler stadig 9,10.

I modsætning til AS er blodpladerig plasma (PRP) afledt af tilsætning af et antikoagulant under fremstillingen med yderligere differentiel centrifugering og kemisk aktivering af blodpladerne. Sammenlignet med AS er der adskillige kemikalier og vækstfaktorer, såsom TGF-β, vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) og EGF, til stede i PRP. Det er også blevet anvendt på okulære overfladesygdomme med kliniske fordele i symptomlindring11.

Tværforbindelsen mellem epiteldefekter og betændelse er kompleks. Især immunopatofysiologi er et andet vigtigt spørgsmål i okulære overfladesygdomme. Proinflammatoriske cytokiner, såsom IL-1β og IFN-γ, menes at være afgørende mediatorer i inflammatoriske kaskader12. Nye behandlingsveje åbnes således baseret på forståelse af immunmekanismen. Strategier til at stoppe denne inflammatoriske proces, herunder produktion af interleukin-1-receptorantagonist (IL-1Ra) og andre antiinflammatoriske cytokiner, kan også spille en vigtig rolle i okulære overfladesygdomme13,14,15.

Siden 1998 er ortokin, et kommercialiseret autologt konditioneret serum (ACS), blevet anvendt klinisk hos ortopædiske patienter, der lider af slidgigt (OA), reumatoid arthritis (RA) og rygsygdomme13. Sammenlignet med AS og PRP er behandling med kemisk overtrukne glasperler og hypoxisk inkubation for at aktivere monocytter de specifikke træk ved ACS16. Teoretisk set kan flere antiinflammatoriske faktorer udskilles ved at tilføje overlevelsesstress til cellerne, hvilket resulterer i en højere koncentration af essentielle immunmodulerende komponenter, herunder IL-1Ra. De forbedrede terapeutiske fordele ved ACS i OA sammenlignet med AS er også blevet rapporteret17. Okulære overfladesygdomme deler lignende immun baggrund med ortopædiske inflammatoriske sygdomme i nogle henseender. Baseret på de vellykkede resultater af human blodafledt terapi på det ortopædiske område kan ACS derfor have fordele i forhold til konventionelle behandlinger i klinisk praksis ved epitheliotropiske og immunmodulerende egenskaber. Selvom ACS har været meget udbredt i ortopædiske inflammatoriske sygdomme, skal dets kliniske anvendelser inden for oftalmologi stadig undersøges, hvilket kan hindres af dets høje omkostninger, mangel på litteraturstøtte og manglende standardisering af forberedelsesprocessen, hvilket resulterer i forskellig ydeevne.

I denne videoartikel blev en ny, omkostningseffektiv og bekvem metode demonstreret til at generere den modificerede ACS (mACS) eller plasma rig på vækstfaktorer (PRGF), der producerer en øjendråbeopløsning med en sammenlignelig praktisk værdi med kommercialiserede ACS’er. Nøgleideerne om at tilføje antikoagulantia og udløse blodcellerne til at udskille antiinflammatoriske cytokiner ved stresset inkubation blev bibeholdt, men i modsætning til de kemisk inducerede metoder, såsom dem, der er baseret på CrSO 4-coatede glasperler og kommercielle kits, induceres den kritiske stressstatus fysisk ved hypoxisk inkubation i denne metode. Desuden blev glycerol tilsat for at give ekstra fordele, herunder en stigning i stabiliteten af blodkarcellernes membran, vedligeholdelse af et korrekt osmotisk ekstracellulært væsketryk18 og en passende kilde til næringsstoffer under hypoxiske forhold, der undgår overbelastning af cellerne.

Protocol

Forskningen blev udført i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer i begyndelsen af protokolafsnittet. Alle protokoller og procedurer blev udført i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen og blev gennemgået og godkendt af Chang Gung Medical Foundation Institutional Review Board. Alle frivillige blev informeret om arten af denne undersøgelse og underskrev en informeret samtykkeformular, inden de blev optaget. De forbrugsstoffer, der kræves til hele forsøgsproceduren, er vist i figur <strong class="x…

Representative Results

Figur 1 og figur 2 viser de materialer, der er nødvendige til eksperimentet, og figur 3 viser de sekventielle trin og de vellykkede midtprodukter under forberedelsen af mACS. Først blev 0,5 ml 10% glycerolopløsning tilsat i hvert 10 ml sterilt reagensglas (figur 3A). Derefter blev 60-70 ml venøst blod opnået fra patienten, og 10 ml blod blev injiceret i hvert rør (figur 3B</st…

Discussion

I denne undersøgelse beskrives en protokol til fremstilling af mACS, og fordelen ved mACS øjendråber i sårheling af dyremodeller vises yderligere. Den afgørende ændring af denne mACS-protokol er tilsætning af ca. 0,5 ml 10% glycerolopløsning i hvert reagensglas, hvilket skaber passende hypoxiske forhold under 4 timers inkubation ved 37 °C. Denne indstilling giver AS korrekt stress og beder celler om at udskille de nødvendige vækstfaktorer, der hjælper sårheling. 0,22 μm filteret kan hjælpe med at eliminer…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne takker Ya-Lan Chien og Chia-Ying Lee for fremragende teknisk assistance og OnLine English Company for den sproglige udgave. Denne undersøgelse blev delvist finansieret af Chang Gung Medical Research Project (bevillingsnr. CMRPG3L1491).

Materials

 96-well culture plate Merck KGaA, Germany CLS3997
Barraquer lid speculum katena K1-5355 15 mm
Barraquer needle holder Katena K6-3310 without lock 
Barron Vacuum Punch 8.0 mm katena K20-2108 for cutting filter paper
BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units Becton,Dickinson and Company, US 367880 At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination
BD 21 G butterfly-winged infusion set Becton,Dickinson and Company, US 367281 For even distribution of glycerol solution
C57BL/6 mice  National Laboratory Animal Center RMRC11005 for mouse model
Castroviejo forceps 0.12 mm katena  K5-2500
Centrifuge Eppendorf, Germany 5811000428 3,500 x g for 10 min
Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle Cheng Yi Chemical, Taiwan CP405141 Must be sterile and as the storage container for the final product
Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX CHI-675 for debridement of the corneal epithelium
Dulbecco's modified minimal essential medium Merck KGaA, Germany D6429
Filter paper  Toyo Roshi Kaisha,Ltd. 1.11
Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P OPTITECH OPTFL100 staining for corneal epithelial defect 
Incubator Firstek, Taiwan S300S 37 °C for 4 h
Kanam sterile gloves Kanam Latex Industries, India EN455 For aseptic operation
Merck 0.22 µm filter Merck KGaA, Germany PR05359 At least 2 filters for mACS filtration
Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan 19496 To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells
Normal saline TAIWAN BIOTECH CO., LTD. 100-120-1101
Skin biopsy punch 2mm STIEFEL 22650
Stereomicroscope Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA SV11 microscope for surgery
Terumo 18 G needle Terumo, Taiwan SMACF0120-18BX 3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation
Terumo 20.0 mL syringe Terumo, Taiwan MDSS20ES Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation.
Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle Terumo, Taiwan MDSS03S2325 3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles.
Westcott Tenotomy Scissors Medium katena K4-3004

References

  1. Fox, R. I., Chan, R., Michelson, J. B., Belmont, J. B., Michelson, P. E. Beneficial effect of artificial tears made with autologous serum in patients with keratoconjunctivitis sicca. Arthritis and Rheumatology. 27 (4), 459-461 (1984).
  2. Noble, B. A., et al. Comparison of autologous serum eye drops with conventional therapy in a randomised controlled crossover trial for ocular surface disease. The British Journal of Ophthalmology. 88 (5), 647-652 (2004).
  3. Bradley, J. C., Bradley, R. H., McCartney, D. L., Mannis, M. J. Serum growth factor analysis in dry eye syndrome. Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (8), 717-720 (2008).
  4. Alshammari, T. M., Al-Hassan, A. A., Hadda, T. B., Aljofan, M. Comparison of different serum sample extraction methods and their suitability for mass spectrometry analysis. Saudi Pharmaceutical Journal. 23 (6), 689-697 (2015).
  5. Tsubota, K., et al. Treatment of dry eye by autologous serum application in Sjögren’s syndrome. The British Journal of Ophthalmology. 83 (4), 390-395 (1999).
  6. Urzua, C. A., Vasquez, D. H., Huidobro, A., Hernandez, H., Alfaro, J. Randomized double-blind clinical trial of autologous serum versus artificial tears in dry eye syndrome. Current Eye Research. 37 (8), 684-688 (2012).
  7. Cui, D., Li, G., Akpek, E. K. Autologous serum eye drops for ocular surface disorders. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 21 (5), 493-499 (2021).
  8. Jirsova, K., et al. The application of autologous serum eye drops in severe dry eye patients; subjective and objective parameters before and after treatment. Current Eye Research. 39 (1), 21-30 (2014).
  9. Pan, Q., Angelina, A., Marrone, M., Stark, W. J., Akpek, E. K. Autologous serum eye drops for dry eye. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2 (2), (2017).
  10. Wang, L., et al. Autologous serum eye drops versus artificial tear drops for dry eye disease: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Ophthalmic Research. 63 (5), 443-451 (2020).
  11. Soni, N. G., Jeng, B. H. Blood-derived topical therapy for ocular surface diseases. The British Journal of Ophthalmology. 100 (1), 22-27 (2016).
  12. Solomon, A., et al. anti-inflammatory forms of interleukin-1 in the tear fluid and conjunctiva of patients with dry-eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 42 (10), 2283-2292 (2001).
  13. Meijer, H., Reinecke, J., Becker, C., Tholen, G., Wehling, P. The production of anti-inflammatory cytokines in whole blood by physico-chemical induction. Inflammation Research. 52 (10), 404-407 (2003).
  14. Bielory, B. P., Shah, S. P., O’Brien, T. P., Perez, V. L., Bielory, L. Emerging therapeutics for ocular surface disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (5), 477-486 (2016).
  15. Stevenson, W., Chauhan, S. K., Dana, R. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).
  16. Yang, J., Guo, A., Li, Q., Wu, J. Platelet-rich plasma attenuates interleukin-1β-induced apoptosis and inflammation in chondrocytes through targeting hypoxia-inducible factor-2α. Tissue and Cell. 73, 101646 (2021).
  17. Shakouri, S. K., Dolati, S., Santhakumar, J., Thakor, A. S., Yarani, R. Autologous conditioned serum for degenerative diseases and prospects. Growth Factors. 39 (1-6), 59-70 (2021).
  18. Gull, M., Pasek, M. A. The role of glycerol and its derivatives in the biochemistry of living organisms, and their prebiotic origin and significance in the evolution of life. Catalysts. 11 (1), 86 (2021).
  19. Drew, V. J., Tseng, C. L., Seghatchian, J., Burnouf, T. Reflections on dry eye syndrome treatment: therapeutic role of blood products. Frontiers in Medicine. 5, 33 (2018).
  20. Hung, K. H., Yeh, L. K. Ex vivo and in vivo animal models for mechanical and chemical injuries of corneal epithelium. Journal of Visualized Experiments. (182), e63217 (2022).
  21. Geerling, G., Maclennan, S., Hartwig, D. Autologous serum eye drops for ocular surface disorders. The British Journal of Ophthalmology. 88 (11), 1467-1474 (2004).
  22. Rutgers, M., Saris, D. B., Dhert, W. J., Creemers, L. B. Cytokine profile of autologous conditioned serum for treatment of osteoarthritis, in vitro effects on cartilage metabolism and intra-articular levels after injection. Arthritis Research & Therapy. 12 (3), R114 (2010).
  23. Antebi, B., et al. Short-term physiological hypoxia potentiates the therapeutic function of mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 265 (2018).
  24. Chen, Y. M., Wang, W. Y., Lin, Y. C., Tsai, S. H., Lou, Y. T. Use of autologous serum eye drops with contact lenses in the treatment of chemical burn-induced bilateral corneal persistent epithelial defects. BioMed Research International. 2022, 6600788 (2022).
  25. Diaz-Valle, D., et al. Comparison of the efficacy of topical insulin with autologous serum eye drops in persistent epithelial defects of the cornea. Acta Ophthalmologica. 100 (4), e912-e919 (2022).
  26. Metheetrairut, C., et al. Comparison of epitheliotrophic factors in platelet-rich plasma versus autologous serum and their treatment efficacy in dry eye disease. Scientific Reports. 12 (1), 8906 (2022).
  27. NaPier, E., Camacho, M., McDevitt, T. F., Sweeney, A. R. Neurotrophic keratopathy: current challenges and future prospects. Annals of Medicine. 54 (1), 666-673 (2022).
  28. Garcia-Conca, V., et al. Efficacy and safety of treatment of hyposecretory dry eye with platelet-rich plasma. Acta Ophthalmologica. 97 (2), e170-e178 (2019).
  29. Gholian, S., et al. Use of autologous conditioned serum dressings in hard-to-heal wounds: a randomised prospective clinical trial. Journal of Wound Care. 31 (1), 68-77 (2022).
  30. Raeissadat, S. A., Rayegani, S. M., Jafarian, N., Heidari, M. Autologous conditioned serum applications in the treatment of musculoskeletal diseases: a narrative review. Future Science OA. 8 (2), 776 (2022).
  31. Tokawa, P. K. A., Brossi, P. M., Baccarin, R. Y. A. Autologous conditioned serum in equine and human orthopedic therapy: A systematic review. Research in Veterinary Science. 146, 34-52 (2022).
  32. Evans, C. H., Chevalier, X., Wehling, P. Autologous conditioned serum. Physical Medicine and Rehabilitation. Clinics of North America. 27 (4), 893-908 (2016).
  33. Coskun, H. S., Yurtbay, A., Say, F. Platelet rich plasma versus autologous conditioned serum in osteoarthritis of the knee: clinical results of a five-year retrospective study. Cureus. 14 (4), e24500 (2022).
check_url/kr/64911?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Hsiung, C., Liu, Y., Su, C., Hsiung, C., Hung, K., Yeh, L. Production of Modified Autologous Conditioned Serum and Ex Vivo Assessment of Its Healing Potential in Murine Corneal Epithelium. J. Vis. Exp. (193), e64911, doi:10.3791/64911 (2023).

View Video