Isolatie en transcriptoomanalyse van plantenceltypen
Summary
De haalbaarheid en effectiviteit van high-throughput scRNA-seq-methoden luiden een eencellig tijdperk in plantenonderzoek in. Hier wordt een robuuste en complete procedure gepresenteerd voor het isoleren van specifieke Arabidopsis thaliana wortelceltypen en de daaropvolgende transcriptoombibliotheekconstructie en -analyse.
Abstract
In meercellige organismen kunnen ontwikkelingsprogrammering en omgevingsreacties zeer uiteenlopend zijn in verschillende celtypen of zelfs binnen cellen, wat bekend staat als cellulaire heterogeniteit. In de afgelopen jaren zijn single-cell en cell-type isolatie in combinatie met next-generation sequencing (NGS) technieken belangrijke hulpmiddelen geworden voor het bestuderen van biologische processen bij single-cell resolutie. Het isoleren van plantencellen is echter relatief moeilijker vanwege de aanwezigheid van plantencelwanden, wat de toepassing van eencellige benaderingen in planten beperkt. Dit protocol beschrijft een robuuste procedure voor fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)-gebaseerde eencellige en celtype-isolatie met plantencellen, die geschikt is voor downstream multi-omics-analyse en andere studies. Met behulp van Arabidopsis wortel fluorescerende markerlijnen, laten we zien hoe bepaalde celtypen, zoals xyleem-pool pericycle cellen, laterale wortel initiële cellen, laterale wortel cap cellen, cortexcellen en endodermale cellen, worden geïsoleerd. Bovendien is er ook een effectieve downstream transcriptoomanalysemethode met behulp van Smart-seq2 beschikbaar. De celisolatiemethode en transcriptoomanalysetechnieken kunnen worden aangepast aan andere celtypen en plantensoorten en hebben een breed toepassingspotentieel in de plantenwetenschap.
Introduction
Cellen zijn de fundamentele eenheid van alle levende organismen en vervullen structurele en fysiologische functies. Hoewel de cellen in meercellige organismen schijnbare synchroniciteit vertonen, vertonen cellen van verschillende typen en individuele cellen verschillen in hun transcriptomen tijdens ontwikkeling en omgevingsreacties. High-throughput single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) biedt ongekende kracht voor het begrijpen van cellulaire heterogeniteit. Het toepassen van scRNA-seq in de plantenwetenschappen heeft bijgedragen aan het succesvol construeren van een plantencelatlas1, is gebruikt om zeldzame cellulaire taxa in plantenweefsels2 te identificeren, heeft inzicht gegeven in de samenstelling van celtypen in plantenweefsels en is gebruikt om cellulaire identiteit en belangrijke functies te identificeren die worden gebruikt tijdens de ontwikkeling en differentiatie van planten. Daarnaast is het mogelijk om spatiotemporale ontwikkelingstrajecten in plantenweefsels 1,2,3 af te leiden om nieuwe markergenen 4 te ontdekken en de functies van belangrijke transcriptiefactoren5 te bestuderen met behulp van scRNA-seq om het evolutionaire behoud van hetzelfde celtype in verschillende planten te onthullen 3. Abiotische spanningen behoren tot de belangrijkste omgevingsinvloeden op de groei en ontwikkeling van planten. Door de veranderingen in de samenstelling van celtypen in plantenweefsels onder verschillende behandelingsomstandigheden te onderzoeken door middel van single-cell transcriptoomsequencing, kan men ook het abiotische stressresponsmechanismeoplossen 6.
Het potentieel voor het oplossen van transcriptionele heterogeniteit tussen celtypen met behulp van scRNA-sequencing hangt af van de celisolatiemethode en het sequencingplatform. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) is een veelgebruikte techniek voor het isoleren van een subpopulatie van cellen voor scRNA-seq op basis van lichtverstrooiing en de fluorescentie-eigenschappen van de cellen. De ontwikkeling van fluorescerende markerlijnen door transgene technologie heeft de efficiëntie van celisolatie door FACS7 sterk verbeterd. Het uitvoeren van scRNA-seq met behulp van Smart-seq28 verbetert verder het vermogen om de cellulaire heterogeniteit te ontleden. De Smart-seq2-methode heeft een goede gevoeligheid voor gendetectie en kan genen detecteren, zelfs met een lage transcriptinvoer9. Naast het verzamelen van bulkcellen bieden moderne celsorteerders een sorteerformaat voor één celindex, waardoor transcriptoomanalyse met eencellige resolutie mogelijk is met behulp van Smart-seq210 of andere gemultiplexte RNA-seq-methoden, zoals CEL-seq211. Eencellige of celachtige sortering kan mogelijk worden gebruikt voor vele andere downstream-toepassingen, zoals parallelle multi-omics-studies12,13. Hier wordt een robuust en veelzijdig protocol gepresenteerd voor het isoleren van plantenceltypen, zoals xyleempolige pericyclecellen, laterale wortelkapcellen, laterale wortelinitiële cellen, cortexcellen en endodermale cellen uit de wortels van Arabidopsis thaliana markercellijnen door FACS. Het protocol omvat verder het bouwen van de Smart-seq2-bibliotheek voor downstream transcriptoomanalyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het op Smart-seq2 gebaseerde protocol kan betrouwbare sequencingbibliotheken genereren uit enkele honderden cellen8. De kwaliteit van het uitgangsmateriaal is essentieel voor de nauwkeurigheid van de transcriptoomanalyse. FACS is een krachtig hulpmiddel voor het voorbereiden van cellen van belang, maar deze procedure, met name de protoplastische stap, moet worden geoptimaliseerd voor plantaardige toepassingen. Laser capture microdissection (LCM) of handmatig ontleedde cellen kunnen ook worden gebr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We hebben dit protocol opgezet in de eencellige multi-omics-faciliteit van de School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, en werden ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 32070608), het Shanghai Pujiang Program (Grant No. 20PJ1405800) en Shanghai Jiao Tong University (Grant Nos. Agri-X20200202, 2019TPB05).
Materials
| 0.22 µm strainer | Sorfa | 622110 | |
| Agar | Yeasen | 70101ES76 | |
| Agilent fragment analyzer | Aglient | Aglient 5200 | |
| Agilent high-sensitivity DNA kit | Aglient | DNF-474-0500 | |
| Ampure XP beads | BECKMAN | A63881 | |
| Betaine | yuanye | S18046-100g | |
| Bleach | Mr Muscle | FnBn83BK | 20% (v/v) bleach |
| BSA | sigma | 9048-46-8 | |
| CaCl2 | yuanye | S24109-500g | |
| Cellulase R10 | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Cellulase RS | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Centrifuge tube (1.5 mL) | Eppendolf | 30121589 | |
| DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants | Beyotime | R0127 | |
| dNTPs (10 mM) | NEB | N0447S | |
| DTT (0.1 M) | invitrogen |
18090050 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 100092680 | |
| FACS | BD FACS Melody | BD-65745 | |
| FACS | Sony | SH800S | |
| Filter tip (1000 µL) | Thermo Scientific | TF112-1000-Q | |
| Filter tip (200 µL) | Thermo Scientific | TF140-200-Q | |
| Filter tip (10 µL) | Thermo Scientific | TF104-10-Q | |
| Filter tip (100 µL) | Thermo Scientific | TF113-100-Q | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse Ni-E | |
| Four-Dimensional Rotating Mixer | Kylin -Bell | BE-1100 | |
| Hemicellulase | sigma | 9025-56-3 | |
| IS PCR primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3' |
||
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X) | Roche | 7958935001 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 7447-40-7 | |
| Macerozyme R10 | Yakult (Japan) | 9032-75-1 | |
| Magnetic separation stand | invitrogen | 12321D | |
| Mannitol | aladdin | 69-65-8 | |
| MES | aladdin | 145224948 | |
| MgCl2 | yuanye | R21455-500ml | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | Centrifuge 5425 | |
| Micro-mini-centrifuge | Titan | Timi-10k | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | illumina | FC-131-1024 | |
| oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3' |
||
| PCR instrument | Thermal cycler | A24811 | |
| Pectolyase | Yakult (Japan) | 9033-35-6 | |
| Plant marker lines | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | ||
| Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit | invitrogen | Q33231 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | invitrogen | Q32866 | |
| RNase inhibitor | Thermo Scientific | EO0382 | |
| RNase-free water | invitrogen | 10977023 | |
| Solution A | 400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl | ||
| Solution B | 1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 % (w/v)hemicellulase, 0.5 % (w/v)pectolyase and 1 % (w/v) Macerozyme R10 of in a fresh aliquot of solution A | ||
| Sterile pestle | BIOTREAT | 453463 | |
| Strainer (40 µm ) | Sorfa | 251100 | |
| Superscript enzyme (200 U/µL) | invitrogen | 18090050 | |
| SuperScript VI buffer (5x) | invitrogen | 18090050 | |
| T0est tube (5 mL) | BD Falcon | 352052 | |
| Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL) | AXYGEN | PCR-05-C | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A600198-0500 | |
| TSO primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3' |
||
| Vortex | Titan | VM-T2 |
References
- Zhang, T. -. Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -. H., Wang, J. -. W. Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root. Nature Communications. 12 (1), 2053 (2021).
- Denyer, T., et al. Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing. Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).
- Liu, Q., et al. Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution. Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).
- Liu, Z., et al. Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing. Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).
- Shahan, R., et al. A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants. Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).
- Wendrich, J. R., et al. Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions. Science. 370 (6518), (2020).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2. Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).
- Serrano-Ron, L., et al. Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation. Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
- Macaulay, I. C., et al. G&T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes. Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).
- Angermueller, C., et al. Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity. Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).
- De Rybel, B., et al. A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity. Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).
- Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy. Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).
- Levy, S. E., Myers, R. M. Advancements in next-generation sequencing. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 95-115 (2016).
- Ooi, C. C., et al. High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells. PLoS One. 12 (11), e0188510 (2017).
- Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown. Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).
- Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease. Journal of Open Source Software. 3, 583 (2018).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Kamiya, T., et al. The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).
- Zhang, Y., et al. Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation. Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).
- Haecker, A., et al. Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Development. 131 (3), 657-668 (2004).
- Chen, Q., et al. Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots. Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).
- Nichterwitz, S., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
- Long, J., et al. Nurse cell–derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis. Science. 373 (6550), (2021).
- Gutzat, R., et al. Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns. EMBO Journal. 39 (20), e103667 (2020).
