Isolement et analyse transcriptome de types de cellules végétales
Summary
La faisabilité et l’efficacité des méthodes de séquençage de l’ARNc à haut débit annoncent une ère unicellulaire dans la recherche sur les plantes. La présente ici est une procédure robuste et complète pour isoler des types spécifiques de cellules racinaires d’Arabidopsis thaliana et la construction et l’analyse ultérieures de la bibliothèque de transcriptomes.
Abstract
Dans les organismes multicellulaires, la programmation du développement et les réponses environnementales peuvent être très divergentes dans différents types de cellules ou même au sein des cellules, ce qui est connu sous le nom d’hétérogénéité cellulaire. Ces dernières années, l’isolement unicellulaire et de type cellulaire combiné aux techniques de séquençage de nouvelle génération (NGS) sont devenus des outils importants pour étudier les processus biologiques à résolution unicellulaire. Cependant, l’isolement des cellules végétales est relativement plus difficile en raison de la présence de parois cellulaires végétales, ce qui limite l’application d’approches unicellulaires chez les plantes. Ce protocole décrit une procédure robuste pour l’isolement unicellulaire et de type cellulaire basé sur le tri activé par fluorescence (FACS) avec des cellules végétales, qui convient à l’analyse multi-omique en aval et à d’autres études. À l’aide de lignes de marqueurs fluorescents racinaires d’Arabidopsis , nous démontrons comment des types de cellules particuliers, tels que les cellules péricycliques xylèmes, les cellules initiales des racines latérales, les cellules de la calotte radiculaire latérale, les cellules du cortex et les cellules endodermiques, sont isolés. En outre, une méthode efficace d’analyse du transcriptome en aval utilisant Smart-seq2 est également fournie. La méthode d’isolement cellulaire et les techniques d’analyse du transcriptome peuvent être adaptées à d’autres types de cellules et espèces végétales et ont un large potentiel d’application en phytotechnie.
Introduction
Les cellules sont l’unité fondamentale de tous les organismes vivants et remplissent des fonctions structurelles et physiologiques. Bien que les cellules des organismes multicellulaires montrent une synchronicité apparente, les cellules de différents types et les cellules individuelles présentent des différences dans leurs transcriptomes au cours du développement et des réponses environnementales. Le séquençage d’ARN unicellulaire à haut débit (scRNA-seq) fournit une puissance sans précédent pour comprendre l’hétérogénéité cellulaire. L’application de scRNA-seq en sciences végétales a contribué à la construction réussie d’un atlas des cellules végétales1, a été utilisée pour identifier les taxons cellulaires rares dans les tissus végétaux2, a fourni un aperçu de la composition des types cellulaires dans les tissus végétaux et a été utilisée pour identifier l’identité cellulaire et les fonctions importantes utilisées pendant le développement et la différenciation des plantes. De plus, il est possible de déduire des trajectoires de développement spatio-temporelles dans les tissus végétaux 1,2,3 pour découvrir de nouveaux gènes marqueurs4 et étudier les fonctions de facteurs de transcription importants5 en utilisant scRNA-seq afin de révéler la conservation évolutive d’un même type cellulaire chez différentes plantes3. Les stress abiotiques sont parmi les influences environnementales les plus importantes sur la croissance et le développement des plantes. En explorant les changements dans la composition des types cellulaires dans les tissus végétaux dans différentes conditions de traitement grâce au séquençage du transcriptome unicellulaire, on peut également résoudre le mécanisme de réponse au stress abiotique6.
Le potentiel de résolution de l’hétérogénéité transcriptionnelle entre les types cellulaires à l’aide du séquençage de l’ARNc dépend de la méthode d’isolement cellulaire et de la plate-forme de séquençage. Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) est une technique largement utilisée pour isoler une sous-population de cellules pour scRNA-seq en fonction de la diffusion de la lumière et des propriétés de fluorescence des cellules. Le développement de lignes de marqueurs fluorescentes par la technologie transgénique a considérablement amélioré l’efficacité de l’isolement cellulaire par FACS7. La réalisation de scRNA-seq à l’aide de Smart-seq28 améliore encore la capacité à disséquer l’hétérogénéité cellulaire. La méthode Smart-seq2 a une bonne sensibilité pour la détection des gènes et peut détecter les gènes même avec une faible entréede transcrit 9. En plus de la collecte de types de cellules en vrac, les trieurs cellulaires modernes fournissent un format de tri à index unicellulaire, permettant l’analyse du transcriptome à une résolution de cellule unique en utilisant Smart-seq210 ou d’autres méthodes de séquençage d’ARN multiplexé, telles que CEL-seq211. Le tri unicellulaire ou de type cellulaire peut être potentiellement utilisé pour de nombreuses autres applications en aval, telles que les études multi-omiques parallèles12,13. Un protocole robuste et polyvalent est présenté ici pour isoler les types de cellules végétales, telles que les cellules péricycliques xylèmes, les cellules de la calotte radiculaire latérale, les cellules initiales des racines latérales, les cellules du cortex et les cellules endodermiques des racines des lignées cellulaires marqueurs d’Arabidopsis thaliana par FACS. Le protocole implique en outre la construction de la bibliothèque Smart-seq2 pour l’analyse du transcriptome en aval.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole basé sur Smart-seq2 peut générer des bibliothèques de séquençage fiables à partir de plusieurs centaines de cellules8. La qualité du matériel de départ est essentielle pour la précision de l’analyse du transcriptome. FACS est un outil puissant pour préparer les cellules d’intérêt, mais cette procédure, en particulier l’étape de protomination, doit être optimisée pour les applications en usine. La microdissection par capture laser (LCM) ou les cellules disséqu?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous avons mis en place ce protocole dans l’installation multi-omique unicellulaire de l’École d’agriculture et de biologie de l’Université Jiao Tong de Shanghai et avons été soutenus par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subvention n ° 32070608), le programme Pujiang de Shanghai (subvention n ° 20PJ1405800) et l’Université Jiao Tong de Shanghai (subvention n ° Agri-X20200202, 2019TPB05).
Materials
| 0.22 µm strainer | Sorfa | 622110 | |
| Agar | Yeasen | 70101ES76 | |
| Agilent fragment analyzer | Aglient | Aglient 5200 | |
| Agilent high-sensitivity DNA kit | Aglient | DNF-474-0500 | |
| Ampure XP beads | BECKMAN | A63881 | |
| Betaine | yuanye | S18046-100g | |
| Bleach | Mr Muscle | FnBn83BK | 20% (v/v) bleach |
| BSA | sigma | 9048-46-8 | |
| CaCl2 | yuanye | S24109-500g | |
| Cellulase R10 | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Cellulase RS | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Centrifuge tube (1.5 mL) | Eppendolf | 30121589 | |
| DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants | Beyotime | R0127 | |
| dNTPs (10 mM) | NEB | N0447S | |
| DTT (0.1 M) | invitrogen |
18090050 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 100092680 | |
| FACS | BD FACS Melody | BD-65745 | |
| FACS | Sony | SH800S | |
| Filter tip (1000 µL) | Thermo Scientific | TF112-1000-Q | |
| Filter tip (200 µL) | Thermo Scientific | TF140-200-Q | |
| Filter tip (10 µL) | Thermo Scientific | TF104-10-Q | |
| Filter tip (100 µL) | Thermo Scientific | TF113-100-Q | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse Ni-E | |
| Four-Dimensional Rotating Mixer | Kylin -Bell | BE-1100 | |
| Hemicellulase | sigma | 9025-56-3 | |
| IS PCR primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3' |
||
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X) | Roche | 7958935001 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 7447-40-7 | |
| Macerozyme R10 | Yakult (Japan) | 9032-75-1 | |
| Magnetic separation stand | invitrogen | 12321D | |
| Mannitol | aladdin | 69-65-8 | |
| MES | aladdin | 145224948 | |
| MgCl2 | yuanye | R21455-500ml | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | Centrifuge 5425 | |
| Micro-mini-centrifuge | Titan | Timi-10k | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | illumina | FC-131-1024 | |
| oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3' |
||
| PCR instrument | Thermal cycler | A24811 | |
| Pectolyase | Yakult (Japan) | 9033-35-6 | |
| Plant marker lines | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | ||
| Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit | invitrogen | Q33231 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | invitrogen | Q32866 | |
| RNase inhibitor | Thermo Scientific | EO0382 | |
| RNase-free water | invitrogen | 10977023 | |
| Solution A | 400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl | ||
| Solution B | 1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 % (w/v)hemicellulase, 0.5 % (w/v)pectolyase and 1 % (w/v) Macerozyme R10 of in a fresh aliquot of solution A | ||
| Sterile pestle | BIOTREAT | 453463 | |
| Strainer (40 µm ) | Sorfa | 251100 | |
| Superscript enzyme (200 U/µL) | invitrogen | 18090050 | |
| SuperScript VI buffer (5x) | invitrogen | 18090050 | |
| T0est tube (5 mL) | BD Falcon | 352052 | |
| Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL) | AXYGEN | PCR-05-C | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A600198-0500 | |
| TSO primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3' |
||
| Vortex | Titan | VM-T2 |
References
- Zhang, T. -. Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -. H., Wang, J. -. W. Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root. Nature Communications. 12 (1), 2053 (2021).
- Denyer, T., et al. Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing. Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).
- Liu, Q., et al. Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution. Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).
- Liu, Z., et al. Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing. Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).
- Shahan, R., et al. A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants. Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).
- Wendrich, J. R., et al. Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions. Science. 370 (6518), (2020).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2. Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).
- Serrano-Ron, L., et al. Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation. Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
- Macaulay, I. C., et al. G&T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes. Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).
- Angermueller, C., et al. Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity. Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).
- De Rybel, B., et al. A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity. Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).
- Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy. Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).
- Levy, S. E., Myers, R. M. Advancements in next-generation sequencing. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 95-115 (2016).
- Ooi, C. C., et al. High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells. PLoS One. 12 (11), e0188510 (2017).
- Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown. Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).
- Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease. Journal of Open Source Software. 3, 583 (2018).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Kamiya, T., et al. The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).
- Zhang, Y., et al. Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation. Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).
- Haecker, A., et al. Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Development. 131 (3), 657-668 (2004).
- Chen, Q., et al. Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots. Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).
- Nichterwitz, S., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
- Long, J., et al. Nurse cell–derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis. Science. 373 (6550), (2021).
- Gutzat, R., et al. Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns. EMBO Journal. 39 (20), e103667 (2020).
