प्लांट सेल प्रकारों का अलगाव और प्रतिलेख विश्लेषण
Summary
उच्च-थ्रूपुट एससीआरएनए-सेक विधियों की व्यवहार्यता और प्रभावशीलता संयंत्र अनुसंधान में एकल-कोशिका युग की शुरुआत करती है। यहां प्रस्तुत विशिष्ट एराबिडोप्सिस थैलियाना रूट सेल प्रकारों और बाद में ट्रांसस्क्रिप्टम लाइब्रेरी निर्माण और विश्लेषण को अलग करने के लिए एक मजबूत और पूर्ण प्रक्रिया है।
Abstract
बहुकोशिकीय जीवों में, विकासात्मक प्रोग्रामिंग और पर्यावरणीय प्रतिक्रियाएं विभिन्न सेल प्रकारों में या कोशिकाओं के भीतर भी अत्यधिक भिन्न हो सकती हैं, जिसे सेलुलर विषमता के रूप में जाना जाता है। हाल के वर्षों में, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) तकनीकों के साथ संयुक्त एकल-कोशिका और सेल-प्रकार अलगाव एकल-कोशिका संकल्प पर जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण बन गए हैं। हालांकि, प्लांट सेल की दीवारों की उपस्थिति के कारण पौधे की कोशिकाओं को अलग करना अपेक्षाकृत अधिक कठिन है, जो पौधों में एकल-कोशिका दृष्टिकोण के आवेदन को सीमित करता है। यह प्रोटोकॉल प्लांट कोशिकाओं के साथ फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) आधारित सिंगल-सेल और सेल-टाइप अलगाव के लिए एक मजबूत प्रक्रिया का वर्णन करता है, जो डाउनस्ट्रीम मल्टी-ओमिक्स विश्लेषण और अन्य अध्ययनों के लिए उपयुक्त है। एराबिडोप्सिस रूट फ्लोरोसेंट मार्कर लाइनों का उपयोग करते हुए, हम प्रदर्शित करते हैं कि विशेष सेल प्रकार, जैसे कि जाइलम-पोल पेरिसाइकिल कोशिकाएं, पार्श्व जड़ प्रारंभिक कोशिकाएं, पार्श्व रूट कैप कोशिकाएं, कॉर्टेक्स कोशिकाएं और एंडोडर्मल कोशिकाएं, कैसे अलग होती हैं। इसके अलावा, स्मार्ट-सेक 2 का उपयोग करके एक प्रभावी डाउनस्ट्रीम ट्रांसस्क्रिप्टम विश्लेषण विधि भी प्रदान की जाती है। सेल अलगाव विधि और प्रतिलेख विश्लेषण तकनीकों को अन्य सेल प्रकारों और पौधों की प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और पौधे विज्ञान में व्यापक अनुप्रयोग क्षमता है।
Introduction
कोशिकाएं सभी जीवित जीवों की मौलिक इकाई हैं और संरचनात्मक और शारीरिक कार्य करती हैं। यद्यपि बहुकोशिकीय जीवों में कोशिकाएं स्पष्ट समकालिकता दिखाती हैं, विभिन्न प्रकार और व्यक्तिगत कोशिकाओं की कोशिकाएं विकास और पर्यावरणीय प्रतिक्रियाओं के दौरान अपने प्रतिलेख में अंतर पेश करती हैं। उच्च-थ्रूपुट एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण (एससीआरएनए-सेक) सेलुलर विषमता को समझने के लिए अभूतपूर्व शक्ति प्रदान करता है। पादप विज्ञान में एससीआरएनए-सेक को लागू करने से प्लांट सेल एटलस1 के सफलतापूर्वक निर्माण में योगदान दिया गया है, जिसका उपयोग पौधों के ऊतकों में दुर्लभ सेलुलर टैक्सा की पहचान करने के लिए किया गया है2, पौधे के ऊतकों में सेल प्रकारों की संरचना में अंतर्दृष्टि प्रदान की है, और इसका उपयोग सेलुलर पहचान और पौधे के विकास और भेदभाव के दौरान नियोजित महत्वपूर्ण कार्यों की पहचान करने के लिए किया गया है। इसके अलावा, नए मार्कर जीन4 की खोज करने और विभिन्न पौधों में एक ही सेल प्रकार के विकासवादी संरक्षण को प्रकट करने के लिए एससीआरएनए-सेक का उपयोग करके महत्वपूर्ण प्रतिलेखन कारकों5 के कार्यों का अध्ययन करने के लिए पौधे के ऊतकों 1,2,3 में स्थानिक विकास प्रक्षेपपथ का अनुमान लगाना संभव है।. अजैविक तनाव पौधे की वृद्धि और विकास पर सबसे महत्वपूर्ण पर्यावरणीय प्रभावों में से हैं। एकल-कोशिका प्रतिलेख अनुक्रमण के माध्यम से विभिन्न उपचार स्थितियों के तहत पौधे के ऊतकों में कोशिका प्रकारों की संरचना में परिवर्तन की खोज करके, कोई भी अजैविक तनाव प्रतिक्रिया तंत्र6 को हल कर सकता है।
एससीआरएनए अनुक्रमण का उपयोग करके सेल प्रकारों के बीच ट्रांसक्रिप्शनल विषमता को हल करने की क्षमता सेल अलगाव विधि और अनुक्रमण मंच पर निर्भर करती है। फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) प्रकाश प्रकीर्णन और कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति गुणों के आधार पर एससीआरएनए-सेक के लिए कोशिकाओं की उप-आबादी को अलग करने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक है। ट्रांसजेनिक तकनीक द्वारा फ्लोरोसेंट मार्कर लाइनों के विकास ने एफएसीएस7 द्वारा सेल अलगाव की दक्षता में काफी सुधार किया है। स्मार्ट-सेक 28 का उपयोग करके एससीआरएनए-सेक का संचालन सेलुलर विषमता को विच्छेदित करने की क्षमता को और बढ़ाता है। स्मार्ट-सेक 2 विधि में जीन का पता लगाने के लिए अच्छी संवेदनशीलता है और कम प्रतिलेख इनपुट9 के साथ भी जीन का पता लगा सकती है। थोक सेल प्रकार संग्रह के अलावा, आधुनिक सेल सॉर्टर्स एक एकल-सेल इंडेक्स सॉर्टिंग प्रारूप प्रदान करते हैं, जो स्मार्ट-सेक 210 या अन्य मल्टीप्लेक्स आरएनए-सेक विधियों का उपयोग करके एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन पर ट्रांसस्क्रिप्टम विश्लेषण की अनुमति देता है, जैसे कि सीईएल-सेक 211। सिंगल-सेल या सेल-टाइप सॉर्टिंग का उपयोग संभावित रूप से कई अन्य डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, जैसे कि समानांतर मल्टी-ओमिक्स अध्ययन12,13। यहां प्रस्तुत प्लांट सेल प्रकारों को अलग करने के लिए एक मजबूत और बहुमुखी प्रोटोकॉल है, जैसे कि जाइलम-पोल पेरिसाइकिल कोशिकाएं, पार्श्व रूट कैप कोशिकाएं, पार्श्व जड़ प्रारंभिक कोशिकाएं, कॉर्टेक्स कोशिकाएं, और एंडोडर्मल कोशिकाएं एफएसीएस द्वारा एराबिडोप्सिस थैलियाना मार्कर सेल लाइनों की जड़ों से। प्रोटोकॉल में डाउनस्ट्रीम ट्रांसक्रिपटम विश्लेषण के लिए स्मार्ट-सेक 2 लाइब्रेरी का निर्माण शामिल है।
Protocol
Representative Results
Discussion
स्मार्ट-सेक 2-आधारित प्रोटोकॉल कईसैकड़ों कोशिकाओं से विश्वसनीय अनुक्रमण पुस्तकालय उत्पन्न कर सकता है। प्रारंभिक सामग्री की गुणवत्ता प्रतिलेख विश्लेषण की सटीकता के लिए आवश्यक है। एफएसीएस ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हमने इस प्रोटोकॉल को स्कूल ऑफ एग्रीकल्चर एंड बायोलॉजी, शंघाई जिओ टोंग विश्वविद्यालय की एकल-सेल मल्टी-ओमिक्स सुविधा में स्थापित किया, और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 32070608), शंघाई पुजियांग कार्यक्रम (अनुदान संख्या 20पीजे 1405800), और शंघाई जिओ टोंग विश्वविद्यालय (अनुदान संख्या कृषि-एक्स 20200202, 2019 टीपीबी 05) द्वारा समर्थित थे।
Materials
| 0.22 µm strainer | Sorfa | 622110 | |
| Agar | Yeasen | 70101ES76 | |
| Agilent fragment analyzer | Aglient | Aglient 5200 | |
| Agilent high-sensitivity DNA kit | Aglient | DNF-474-0500 | |
| Ampure XP beads | BECKMAN | A63881 | |
| Betaine | yuanye | S18046-100g | |
| Bleach | Mr Muscle | FnBn83BK | 20% (v/v) bleach |
| BSA | sigma | 9048-46-8 | |
| CaCl2 | yuanye | S24109-500g | |
| Cellulase R10 | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Cellulase RS | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Centrifuge tube (1.5 mL) | Eppendolf | 30121589 | |
| DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants | Beyotime | R0127 | |
| dNTPs (10 mM) | NEB | N0447S | |
| DTT (0.1 M) | invitrogen |
18090050 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 100092680 | |
| FACS | BD FACS Melody | BD-65745 | |
| FACS | Sony | SH800S | |
| Filter tip (1000 µL) | Thermo Scientific | TF112-1000-Q | |
| Filter tip (200 µL) | Thermo Scientific | TF140-200-Q | |
| Filter tip (10 µL) | Thermo Scientific | TF104-10-Q | |
| Filter tip (100 µL) | Thermo Scientific | TF113-100-Q | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse Ni-E | |
| Four-Dimensional Rotating Mixer | Kylin -Bell | BE-1100 | |
| Hemicellulase | sigma | 9025-56-3 | |
| IS PCR primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3' |
||
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X) | Roche | 7958935001 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 7447-40-7 | |
| Macerozyme R10 | Yakult (Japan) | 9032-75-1 | |
| Magnetic separation stand | invitrogen | 12321D | |
| Mannitol | aladdin | 69-65-8 | |
| MES | aladdin | 145224948 | |
| MgCl2 | yuanye | R21455-500ml | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | Centrifuge 5425 | |
| Micro-mini-centrifuge | Titan | Timi-10k | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | illumina | FC-131-1024 | |
| oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3' |
||
| PCR instrument | Thermal cycler | A24811 | |
| Pectolyase | Yakult (Japan) | 9033-35-6 | |
| Plant marker lines | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | ||
| Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit | invitrogen | Q33231 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | invitrogen | Q32866 | |
| RNase inhibitor | Thermo Scientific | EO0382 | |
| RNase-free water | invitrogen | 10977023 | |
| Solution A | 400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl | ||
| Solution B | 1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 % (w/v)hemicellulase, 0.5 % (w/v)pectolyase and 1 % (w/v) Macerozyme R10 of in a fresh aliquot of solution A | ||
| Sterile pestle | BIOTREAT | 453463 | |
| Strainer (40 µm ) | Sorfa | 251100 | |
| Superscript enzyme (200 U/µL) | invitrogen | 18090050 | |
| SuperScript VI buffer (5x) | invitrogen | 18090050 | |
| T0est tube (5 mL) | BD Falcon | 352052 | |
| Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL) | AXYGEN | PCR-05-C | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A600198-0500 | |
| TSO primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3' |
||
| Vortex | Titan | VM-T2 |
References
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