Gjennomførbarheten og effektiviteten av scRNA-seq-metoder med høy gjennomstrømning varsler en enkeltcelle-epoke i planteforskning. Presentert her er en robust og komplett prosedyre for isolering av spesifikke Arabidopsis thaliana rotcelletyper og påfølgende transkriptombibliotekkonstruksjon og analyse.
I multicellulære organismer kan utviklingsprogrammering og miljørespons være svært divergerende i forskjellige celletyper eller til og med i celler, som er kjent som cellulær heterogenitet. I de senere år har enkeltcelle- og celletypeisolasjon kombinert med neste generasjons sekvenseringsteknikker (NGS) blitt viktige verktøy for å studere biologiske prosesser ved encelleoppløsning. Imidlertid er isolering av planteceller relativt vanskeligere på grunn av tilstedeværelsen av plantecellevegger, noe som begrenser anvendelsen av enkeltcellede tilnærminger i planter. Denne protokollen beskriver en robust prosedyre for fluorescensaktivert cellesortering (FACS)-basert enkeltcelle- og celletypeisolasjon med planteceller, som er egnet for nedstrøms multi-omics-analyse og andre studier. Ved hjelp av Arabidopsis rotfluorescerende markørlinjer demonstrerer vi hvordan bestemte celletyper, som xylem-pol pericycle celler, laterale rot initialceller, laterale rot cap celler, cortex celler og endodermale celler, er isolert. Videre er det også gitt en effektiv nedstrøms transkriptomanalysemetode ved bruk av Smart-seq2. Celleisolasjonsmetoden og transkriptomanalyseteknikker kan tilpasses andre celletyper og plantearter og har et bredt anvendelsespotensial i plantevitenskap.
Celler er den grunnleggende enheten i alle levende organismer og utfører strukturelle og fysiologiske funksjoner. Selv om cellene i flercellede organismer viser tilsynelatende synkronitet, presenterer celler av forskjellige typer og individuelle celler forskjeller i deres transkriptomer under utviklings- og miljøresponser. High-throughput enkeltcelle RNA-sekvensering (scRNA-seq) gir enestående kraft for å forstå cellulær heterogenitet. Bruk av scRNA-seq i plantevitenskap har bidratt til vellykket konstruksjon av et plantecelleatlas1, har blitt brukt til å identifisere sjeldne cellulære taxa i plantevev2, har gitt innsikt i sammensetningen av celletyper i plantevev, og har blitt brukt til å identifisere cellulær identitet og viktige funksjoner ansatt under planteutvikling og differensiering. I tillegg er det mulig å utlede spatiotemporale utviklingsbaner i plantevev 1,2,3 for å oppdage nye markørgener4 og studere funksjonene til viktige transkripsjonsfaktorer 5 ved hjelp av scRNA-seq for å avsløre evolusjonær bevaring av samme celletype i forskjellige planter 3. Abiotiske påkjenninger er blant de viktigste miljøpåvirkningene på plantevekst og utvikling. Ved å undersøke endringene i sammensetningen av celletyper i plantevev under ulike behandlingsbetingelser gjennom encellet transkriptomsekvensering, kan man også løse den abiotiske stressresponsmekanismen6.
Potensialet for å løse transkripsjonell heterogenitet mellom celletyper ved bruk av scRNA-sekvensering avhenger av celleisolasjonsmetoden og sekvenseringsplattformen. Fluorescensaktivert cellesortering (FACS) er en mye brukt teknikk for å isolere en underpopulasjon av celler for scRNA-seq basert på lysspredning og fluorescensegenskapene til cellene. Utviklingen av fluorescerende markørlinjer ved transgen teknologi har i stor grad forbedret effektiviteten av celleisolasjon av FACS7. Gjennomføring av scRNA-seq ved bruk av Smart-seq28 forbedrer ytterligere evnen til å dissekere den cellulære heterogeniteten. Smart-seq2-metoden har god sensitivitet for gendeteksjon og kan oppdage gener selv med lav transkripsjonsinngang9. I tillegg til bulkcelletypeinnsamling gir moderne cellesorterere et enkeltcelleindekssorteringsformat, noe som tillater transkriptomanalyse ved enkeltcelleoppløsning ved bruk av Smart-seq210 eller andre multipleksede RNA-seq-metoder, for eksempel CEL-seq211. Enkeltcelle- eller celletypesortering kan potensielt brukes til mange andre nedstrømsapplikasjoner, for eksempel parallelle multi-omics-studier12,13. Presentert her er en robust og allsidig protokoll for isolering av plantecelletyper, for eksempel xylem-pole pericycle celler, laterale rot cap celler, laterale rot initialceller, cortex celler og endodermale celler fra røttene til Arabidopsis thaliana markør cellelinjer av FACS. Protokollen innebærer videre å konstruere Smart-seq2-biblioteket for nedstrøms transkriptomanalyse.
Den Smart-seq2-baserte protokollen kan generere pålitelige sekvenseringsbiblioteker fra flere hundre celler8. Kvaliteten på utgangsmaterialet er avgjørende for nøyaktigheten av transkriptomanalysen. FACS er et kraftig verktøy for å forberede celler av interesse, men denne prosedyren, spesielt protoplastingstrinnet, må optimaliseres for planteapplikasjoner. Laserfangstmikrodisseksjon (LCM) eller manuelle dissekerte celler kan også brukes som input25,26,<su…
The authors have nothing to disclose.
Vi satte opp denne protokollen i single-cell multi-omics-anlegget ved School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, og ble støttet av National Natural Science Foundation of China (Grant nr. 32070608), Shanghai Pujiang-programmet (Grant No. 20PJ1405800) og Shanghai Jiao Tong University (Grant Nos. Agri-X20200202, 2019TPB05).
0.22 µm strainer | Sorfa | 622110 | |
Agar | Yeasen | 70101ES76 | |
Agilent fragment analyzer | Aglient | Aglient 5200 | |
Agilent high-sensitivity DNA kit | Aglient | DNF-474-0500 | |
Ampure XP beads | BECKMAN | A63881 | |
Betaine | yuanye | S18046-100g | |
Bleach | Mr Muscle | FnBn83BK | 20% (v/v) bleach |
BSA | sigma | 9048-46-8 | |
CaCl2 | yuanye | S24109-500g | |
Cellulase R10 | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
Cellulase RS | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
Centrifuge tube (1.5 mL) | Eppendolf | 30121589 | |
DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants | Beyotime | R0127 | |
dNTPs (10 mM) | NEB | N0447S | |
DTT (0.1 M) | invitrogen |
18090050 | |
Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 100092680 | |
FACS | BD FACS Melody | BD-65745 | |
FACS | Sony | SH800S | |
Filter tip (1000 µL) | Thermo Scientific | TF112-1000-Q | |
Filter tip (200 µL) | Thermo Scientific | TF140-200-Q | |
Filter tip (10 µL) | Thermo Scientific | TF104-10-Q | |
Filter tip (100 µL) | Thermo Scientific | TF113-100-Q | |
Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse Ni-E | |
Four-Dimensional Rotating Mixer | Kylin -Bell | BE-1100 | |
Hemicellulase | sigma | 9025-56-3 | |
IS PCR primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3' |
||
KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X) | Roche | 7958935001 | |
KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 7447-40-7 | |
Macerozyme R10 | Yakult (Japan) | 9032-75-1 | |
Magnetic separation stand | invitrogen | 12321D | |
Mannitol | aladdin | 69-65-8 | |
MES | aladdin | 145224948 | |
MgCl2 | yuanye | R21455-500ml | |
Microcentrifuges | Eppendorf | Centrifuge 5425 | |
Micro-mini-centrifuge | Titan | Timi-10k | |
MS | Phytotech | M519 | |
Nextera XT DNA Library Preparation Kit | illumina | FC-131-1024 | |
oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3' |
||
PCR instrument | Thermal cycler | A24811 | |
Pectolyase | Yakult (Japan) | 9033-35-6 | |
Plant marker lines | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | ||
Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit | invitrogen | Q33231 | |
Qubit 2.0 fluorometer | invitrogen | Q32866 | |
RNase inhibitor | Thermo Scientific | EO0382 | |
RNase-free water | invitrogen | 10977023 | |
Solution A | 400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl | ||
Solution B | 1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 % (w/v)hemicellulase, 0.5 % (w/v)pectolyase and 1 % (w/v) Macerozyme R10 of in a fresh aliquot of solution A | ||
Sterile pestle | BIOTREAT | 453463 | |
Strainer (40 µm ) | Sorfa | 251100 | |
Superscript enzyme (200 U/µL) | invitrogen | 18090050 | |
SuperScript VI buffer (5x) | invitrogen | 18090050 | |
T0est tube (5 mL) | BD Falcon | 352052 | |
Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL) | AXYGEN | PCR-05-C | |
Triton X-100 | Sangon Biotech | A600198-0500 | |
TSO primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3' |
||
Vortex | Titan | VM-T2 |