Genomförbarheten och effektiviteten av scRNA-seq-metoder med hög genomströmning förebådar en encellsera i växtforskning. Här presenteras en robust och komplett procedur för att isolera specifika Arabidopsis thaliana rotcellstyper och efterföljande transkriptombibliotekskonstruktion och analys.
I flercelliga organismer kan utvecklingsprogrammering och miljösvar vara mycket divergerande i olika celltyper eller till och med inom celler, vilket är känt som cellulär heterogenitet. Under de senaste åren har isolering av encells- och celltyp i kombination med nästa generations sekvenseringstekniker (NGS) blivit viktiga verktyg för att studera biologiska processer med encellsupplösning. Att isolera växtceller är emellertid relativt svårare på grund av närvaron av växtcellväggar, vilket begränsar tillämpningen av encelliga metoder i växter. Detta protokoll beskriver en robust procedur för fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)-baserad encells- och celltypisolering med växtceller, vilket är lämpligt för nedströms multi-omics-analys och andra studier. Med hjälp av Arabidopsis rotfluorescerande markörlinjer demonstrerar vi hur specifika celltyper, såsom xylem-pole pericycle-celler, laterala rotinitialceller, laterala rotlockceller, cortexceller och endodermala celler, isoleras. Dessutom tillhandahålls en effektiv nedströms transkriptomanalysmetod med Smart-seq2. Cellisoleringsmetoden och transkriptomanalysteknikerna kan anpassas till andra celltyper och växtarter och har bred tillämpningspotential inom växtvetenskap.
Celler är den grundläggande enheten för alla levande organismer och utför strukturella och fysiologiska funktioner. Även om cellerna i flercelliga organismer visar uppenbar synkronicitet, uppvisar celler av olika typer och enskilda celler skillnader i deras transkriptom under utveckling och miljösvar. High-throughput single-cell RNA-sekvensering (scRNA-seq) ger oöverträffad kraft för att förstå cellulär heterogenitet. Tillämpning av scRNA-seq inom växtvetenskap har bidragit till att framgångsrikt konstruera en växtcellatlas1, har använts för att identifiera sällsynta cellulära taxa i växtvävnader2, har gett insikt i sammansättningen av celltyper i växtvävnader och har använts för att identifiera cellulär identitet och viktiga funktioner som används under växtutveckling och differentiering. Dessutom är det möjligt att härleda spatiotemporala utvecklingsbanor i växtvävnader 1,2,3 för att upptäcka nya markörgener4 och studera funktionerna hos viktiga transkriptionsfaktorer 5 med hjälp av scRNA-seq för att avslöja det evolutionära bevarandet av samma celltyp i olika växter 3. Abiotiska påfrestningar är bland de viktigaste miljöpåverkan på växttillväxt och utveckling. Genom att utforska förändringarna i sammansättningen av celltyper i växtvävnader under olika behandlingsförhållanden genom encellstranskriptomsekvensering kan man också lösa den abiotiska stressresponsmekanismen6.
Potentialen för att lösa transkriptionell heterogenitet mellan celltyper med scRNA-sekvensering beror på cellisoleringsmetoden och sekvenseringsplattformen. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) är en allmänt använd teknik för att isolera en subpopulation av celler för scRNA-seq baserat på ljusspridning och cellernas fluorescensegenskaper. Utvecklingen av fluorescerande markörlinjer med transgen teknik har avsevärt förbättrat effektiviteten av cellisolering med FACS7. Att genomföra scRNA-seq med Smart-seq28 förbättrar ytterligare förmågan att dissekera den cellulära heterogeniteten. Smart-seq2-metoden har god känslighet för gendetektion och kan detektera gener även med låg transkriptingång9. Förutom insamling av bulkcelltyp tillhandahåller moderna cellsorterare ett sorteringsformat för encellsindex, vilket möjliggör transkriptomanalys vid encellsupplösning med Smart-seq210 eller andra multiplexerade RNA-seq-metoder, såsom CEL-seq211. Sortering av encells- eller celltyp kan potentiellt användas för många andra nedströmsapplikationer, såsom parallella multi-omics-studier12,13. Här presenteras ett robust och mångsidigt protokoll för att isolera växtcelltyper, såsom xylem-pole pericykelceller, laterala rotlockceller, laterala rotinitialceller, cortexceller och endodermala celler från rötterna till Arabidopsis thaliana markörcellinjer av FACS. Protokollet innefattar vidare att konstruera Smart-seq2-biblioteket för transkriptomanalys nedströms.
Det Smart-seq2-baserade protokollet kan generera tillförlitliga sekvenseringsbibliotek från flera hundra celler8. Utgångsmaterialets kvalitet är avgörande för transkriptomanalysens noggrannhet. FACS är ett kraftfullt verktyg för att förbereda celler av intresse, men denna procedur, särskilt protoplastionssteget, måste optimeras för växtapplikationer. Laserinfångningsmikrodissektion (LCM) eller manuella dissekerade celler kan också användas som ingång25,26<s…
The authors have nothing to disclose.
Vi satte upp detta protokoll i encellsanläggningen för multi-omics vid School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, och stöddes av National Natural Science Foundation of China (Grant No. 32070608), Shanghai Pujiang Program (Grant No. 20PJ1405800) och Shanghai Jiao Tong University (Grant Nos. Agri-X20200202, 2019TPB05).
0.22 µm strainer | Sorfa | 622110 | |
Agar | Yeasen | 70101ES76 | |
Agilent fragment analyzer | Aglient | Aglient 5200 | |
Agilent high-sensitivity DNA kit | Aglient | DNF-474-0500 | |
Ampure XP beads | BECKMAN | A63881 | |
Betaine | yuanye | S18046-100g | |
Bleach | Mr Muscle | FnBn83BK | 20% (v/v) bleach |
BSA | sigma | 9048-46-8 | |
CaCl2 | yuanye | S24109-500g | |
Cellulase R10 | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
Cellulase RS | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
Centrifuge tube (1.5 mL) | Eppendolf | 30121589 | |
DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants | Beyotime | R0127 | |
dNTPs (10 mM) | NEB | N0447S | |
DTT (0.1 M) | invitrogen |
18090050 | |
Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 100092680 | |
FACS | BD FACS Melody | BD-65745 | |
FACS | Sony | SH800S | |
Filter tip (1000 µL) | Thermo Scientific | TF112-1000-Q | |
Filter tip (200 µL) | Thermo Scientific | TF140-200-Q | |
Filter tip (10 µL) | Thermo Scientific | TF104-10-Q | |
Filter tip (100 µL) | Thermo Scientific | TF113-100-Q | |
Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse Ni-E | |
Four-Dimensional Rotating Mixer | Kylin -Bell | BE-1100 | |
Hemicellulase | sigma | 9025-56-3 | |
IS PCR primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3' |
||
KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X) | Roche | 7958935001 | |
KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 7447-40-7 | |
Macerozyme R10 | Yakult (Japan) | 9032-75-1 | |
Magnetic separation stand | invitrogen | 12321D | |
Mannitol | aladdin | 69-65-8 | |
MES | aladdin | 145224948 | |
MgCl2 | yuanye | R21455-500ml | |
Microcentrifuges | Eppendorf | Centrifuge 5425 | |
Micro-mini-centrifuge | Titan | Timi-10k | |
MS | Phytotech | M519 | |
Nextera XT DNA Library Preparation Kit | illumina | FC-131-1024 | |
oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3' |
||
PCR instrument | Thermal cycler | A24811 | |
Pectolyase | Yakult (Japan) | 9033-35-6 | |
Plant marker lines | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | ||
Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit | invitrogen | Q33231 | |
Qubit 2.0 fluorometer | invitrogen | Q32866 | |
RNase inhibitor | Thermo Scientific | EO0382 | |
RNase-free water | invitrogen | 10977023 | |
Solution A | 400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl | ||
Solution B | 1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 % (w/v)hemicellulase, 0.5 % (w/v)pectolyase and 1 % (w/v) Macerozyme R10 of in a fresh aliquot of solution A | ||
Sterile pestle | BIOTREAT | 453463 | |
Strainer (40 µm ) | Sorfa | 251100 | |
Superscript enzyme (200 U/µL) | invitrogen | 18090050 | |
SuperScript VI buffer (5x) | invitrogen | 18090050 | |
T0est tube (5 mL) | BD Falcon | 352052 | |
Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL) | AXYGEN | PCR-05-C | |
Triton X-100 | Sangon Biotech | A600198-0500 | |
TSO primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3' |
||
Vortex | Titan | VM-T2 |