Bitki Hücre Tiplerinin İzolasyonu ve Transkriptom Analizi
Summary
Yüksek verimli scRNA-seq yöntemlerinin fizibilitesi ve etkinliği, bitki araştırmalarında tek hücreli bir çağın habercisidir. Burada, spesifik Arabidopsis thaliana kök hücre tiplerinin izole edilmesi ve ardından transkriptom kütüphanesi yapımı ve analizi için sağlam ve eksiksiz bir prosedür sunulmaktadır.
Abstract
Çok hücreli organizmalarda, gelişimsel programlama ve çevresel tepkiler, farklı hücre tiplerinde ve hatta hücresel heterojenite olarak bilinen hücreler içinde oldukça farklı olabilir. Son yıllarda, yeni nesil dizileme (NGS) teknikleriyle birleştirilen tek hücreli ve hücre tipi izolasyon, biyolojik süreçleri tek hücreli çözünürlükte incelemek için önemli araçlar haline gelmiştir. Bununla birlikte, bitki hücrelerinin izole edilmesi, bitkilerde tek hücreli yaklaşımların uygulanmasını sınırlayan bitki hücre duvarlarının varlığı nedeniyle nispeten daha zordur. Bu protokol, aşağı akış multi-omik analizi ve diğer çalışmalar için uygun olan, bitki hücreleri ile floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) tabanlı tek hücreli ve hücre tipi izolasyon için sağlam bir prosedürü açıklamaktadır. Arabidopsis kök floresan işaretleyici çizgilerini kullanarak, ksilem-kutup perisiklus hücreleri, lateral kök başlangıç hücreleri, lateral kök kapak hücreleri, korteks hücreleri ve endodermal hücreler gibi belirli hücre tiplerinin nasıl izole edildiğini gösteriyoruz. Ayrıca, Smart-seq2 kullanan etkili bir aşağı akış transkriptom analiz yöntemi de sağlanmaktadır. Hücre izolasyon yöntemi ve transkriptom analiz teknikleri, diğer hücre tiplerine ve bitki türlerine uyarlanabilir ve bitki biliminde geniş uygulama potansiyeline sahiptir.
Introduction
Hücreler tüm canlı organizmaların temel birimidir ve yapısal ve fizyolojik işlevleri yerine getirir. Çok hücreli organizmalardaki hücreler belirgin bir eşzamanlılık göstermesine rağmen, farklı tipteki hücreler ve bireysel hücreler, gelişim ve çevresel tepkiler sırasında transkriptomlarında farklılıklar gösterir. Yüksek verimli tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq), hücresel heterojenliği anlamak için benzeri görülmemiş bir güç sağlar. ScRNA-seq’in bitki bilimlerinde uygulanması, bir bitki hücresi atlası1’in başarılı bir şekilde oluşturulmasına katkıda bulunmuş, bitki dokularındaki nadir hücresel taksonları tanımlamak için kullanılmıştır2, bitki dokularındaki hücre tiplerinin bileşimi hakkında fikir vermiş ve hücresel kimliği ve bitki gelişimi ve farklılaşması sırasında kullanılan önemli işlevleri tanımlamak için kullanılmıştır. Ek olarak, yeni belirteç genleri keşfetmek için bitki dokularındaki uzaysal zamansal gelişimsel yörüngeleri çıkarmak mümkündür 1,2,3 4 ve farklı bitkilerde aynı hücre tipinin evrimsel korunumunu ortaya çıkarmak için scRNA-seq kullanarak önemli transkripsiyon faktörlerinin işlevlerini incelemek5. Abiyotik stresler, bitki büyümesi ve gelişimi üzerindeki en önemli çevresel etkiler arasındadır. Tek hücreli transkriptom dizilimi yoluyla farklı tedavi koşulları altında bitki dokularındaki hücre tiplerinin bileşimindeki değişiklikleri araştırarak, abiyotik stres yanıt mekanizması6’yı da çözebilirsiniz.
ScRNA dizilimini kullanarak hücre tipleri arasındaki transkripsiyonel heterojenliği çözme potansiyeli, hücre izolasyon yöntemine ve dizileme platformuna bağlıdır. Floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS), ışık saçılmasına ve hücrelerin floresan özelliklerine dayanan scRNA-seq için hücrelerin bir alt popülasyonunu izole etmek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Transgenik teknoloji ile floresan işaretleyici hatlarının geliştirilmesi, FACS7 ile hücre izolasyonunun verimliliğini büyük ölçüde artırmıştır. Smart-seq28 kullanarak scRNA-seq iletmek, hücresel heterojeniteyi disseke etme yeteneğini daha da geliştirir. Smart-seq2 yöntemi, gen tespiti için iyi bir duyarlılığa sahiptir ve düşük bir transkript girişi9 ile bile genleri tespit edebilir. Toplu hücre tipi toplamaya ek olarak, modern hücre sıralayıcıları, Smart-seq210 veya CEL-seq211 gibi diğer çoğullanmış RNA-seq yöntemlerini kullanarak tek hücreli çözünürlükte transkriptom analizine izin veren tek hücreli bir dizin sıralama formatı sağlar. Tek hücreli veya hücre tipi sıralama, paralel multi-omik çalışmalar12,13 gibi diğer birçok aşağı akış uygulaması için potansiyel olarak kullanılabilir. Burada, ksilem-kutup perisiklus hücreleri, lateral kök kapak hücreleri, lateral kök başlangıç hücreleri, korteks hücreleri ve endodermal hücreler gibi bitki hücre tiplerini FACS tarafından Arabidopsis thaliana marker hücre hatlarının köklerinden izole etmek için sağlam ve çok yönlü bir protokol sunulmaktadır. Protokol ayrıca aşağı akış transkriptom analizi için Smart-seq2 kütüphanesinin oluşturulmasını içerir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Smart-seq2 tabanlı protokol, yüzlerce hücreden güvenilir sıralama kitaplıkları oluşturabilir8. Başlangıç malzemesinin kalitesi, transkriptom analizinin doğruluğu için esastır. FACS, ilgilenilen hücreleri hazırlamak için güçlü bir araçtır, ancak bu prosedür, özellikle de protoplasting adım, bitki uygulamaları için optimize edilmelidir. Lazer yakalama mikrodiseksiyonu (LCM) veya manuel disseke hücreler de girdi25,26 olarak kullanılabilir, bu nede…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu protokolü Şangay Jiao Tong Üniversitesi Tarım ve Biyoloji Fakültesi’nin tek hücreli multi-omik tesisinde kurduk ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 32070608), Şangay Pujiang Programı (Hibe No. 20PJ1405800) ve Şangay Jiao Tong Üniversitesi (Hibe No. Agri-X20200202, 2019TPB05) tarafından desteklendik.
Materials
| 0.22 µm strainer | Sorfa | 622110 | |
| Agar | Yeasen | 70101ES76 | |
| Agilent fragment analyzer | Aglient | Aglient 5200 | |
| Agilent high-sensitivity DNA kit | Aglient | DNF-474-0500 | |
| Ampure XP beads | BECKMAN | A63881 | |
| Betaine | yuanye | S18046-100g | |
| Bleach | Mr Muscle | FnBn83BK | 20% (v/v) bleach |
| BSA | sigma | 9048-46-8 | |
| CaCl2 | yuanye | S24109-500g | |
| Cellulase R10 | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Cellulase RS | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Centrifuge tube (1.5 mL) | Eppendolf | 30121589 | |
| DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants | Beyotime | R0127 | |
| dNTPs (10 mM) | NEB | N0447S | |
| DTT (0.1 M) | invitrogen |
18090050 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 100092680 | |
| FACS | BD FACS Melody | BD-65745 | |
| FACS | Sony | SH800S | |
| Filter tip (1000 µL) | Thermo Scientific | TF112-1000-Q | |
| Filter tip (200 µL) | Thermo Scientific | TF140-200-Q | |
| Filter tip (10 µL) | Thermo Scientific | TF104-10-Q | |
| Filter tip (100 µL) | Thermo Scientific | TF113-100-Q | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse Ni-E | |
| Four-Dimensional Rotating Mixer | Kylin -Bell | BE-1100 | |
| Hemicellulase | sigma | 9025-56-3 | |
| IS PCR primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3' |
||
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X) | Roche | 7958935001 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 7447-40-7 | |
| Macerozyme R10 | Yakult (Japan) | 9032-75-1 | |
| Magnetic separation stand | invitrogen | 12321D | |
| Mannitol | aladdin | 69-65-8 | |
| MES | aladdin | 145224948 | |
| MgCl2 | yuanye | R21455-500ml | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | Centrifuge 5425 | |
| Micro-mini-centrifuge | Titan | Timi-10k | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | illumina | FC-131-1024 | |
| oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3' |
||
| PCR instrument | Thermal cycler | A24811 | |
| Pectolyase | Yakult (Japan) | 9033-35-6 | |
| Plant marker lines | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | ||
| Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit | invitrogen | Q33231 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | invitrogen | Q32866 | |
| RNase inhibitor | Thermo Scientific | EO0382 | |
| RNase-free water | invitrogen | 10977023 | |
| Solution A | 400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl | ||
| Solution B | 1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 % (w/v)hemicellulase, 0.5 % (w/v)pectolyase and 1 % (w/v) Macerozyme R10 of in a fresh aliquot of solution A | ||
| Sterile pestle | BIOTREAT | 453463 | |
| Strainer (40 µm ) | Sorfa | 251100 | |
| Superscript enzyme (200 U/µL) | invitrogen | 18090050 | |
| SuperScript VI buffer (5x) | invitrogen | 18090050 | |
| T0est tube (5 mL) | BD Falcon | 352052 | |
| Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL) | AXYGEN | PCR-05-C | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A600198-0500 | |
| TSO primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3' |
||
| Vortex | Titan | VM-T2 |
References
- Zhang, T. -. Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -. H., Wang, J. -. W. Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root. Nature Communications. 12 (1), 2053 (2021).
- Denyer, T., et al. Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing. Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).
- Liu, Q., et al. Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution. Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).
- Liu, Z., et al. Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing. Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).
- Shahan, R., et al. A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants. Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).
- Wendrich, J. R., et al. Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions. Science. 370 (6518), (2020).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2. Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).
- Serrano-Ron, L., et al. Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation. Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
- Macaulay, I. C., et al. G&T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes. Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).
- Angermueller, C., et al. Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity. Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).
- De Rybel, B., et al. A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity. Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).
- Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy. Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).
- Levy, S. E., Myers, R. M. Advancements in next-generation sequencing. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 95-115 (2016).
- Ooi, C. C., et al. High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells. PLoS One. 12 (11), e0188510 (2017).
- Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown. Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).
- Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease. Journal of Open Source Software. 3, 583 (2018).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Kamiya, T., et al. The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).
- Zhang, Y., et al. Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation. Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).
- Haecker, A., et al. Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Development. 131 (3), 657-668 (2004).
- Chen, Q., et al. Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots. Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).
- Nichterwitz, S., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
- Long, J., et al. Nurse cell–derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis. Science. 373 (6550), (2021).
- Gutzat, R., et al. Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns. EMBO Journal. 39 (20), e103667 (2020).
