Her beskriver vi en protokol til dyrkning af svins tarm 3D-organoider fra kryopræserverede epitelkrypter. Vi beskriver også en metode til at etablere cellemonolag afledt af 3D-organoider, hvilket giver adgang til den apikale side af epitelceller.
Intestinale organoider bruges i stigende grad til at studere tarmepitelet til modellering af fordøjelsessygdomme eller til at undersøge interaktioner med lægemidler, næringsstoffer, metabolitter, patogener og mikrobiotaen. Metoder til dyrkning af tarmorganoider er nu tilgængelige for flere arter, herunder svin, som er en art af stor interesse både som husdyr og som en translationel model for mennesker, for eksempel til at studere zoonotiske sygdomme. Her giver vi en dybdegående beskrivelse af en procedure, der anvendes til dyrkning af svins tarm 3D-organoider fra frosne epitelkrypter. Protokollen beskriver, hvordan man kryopræserverer epitelkrypter fra svinetarmen og de efterfølgende procedurer til dyrkning af 3D tarmorganoider. De vigtigste fordele ved denne metode er (i) den tidsmæssige dissociation af isoleringen af krypter fra kulturen af 3D-organoider, (ii) forberedelsen af store lagre af kryopræserverede krypter afledt af flere tarmsegmenter og fra flere dyr på én gang og dermed (iii) reduktionen i behovet for at prøve frisk væv fra levende dyr. Vi beskriver også en protokol til etablering af cellemonolag afledt af 3D-organoider for at give adgang til den apikale side af epitelceller, som er stedet for interaktioner med næringsstoffer, mikrober eller lægemidler. Samlet set er protokollerne beskrevet her en nyttig ressource til undersøgelse af svinets tarmepitel i veterinær og biomedicinsk forskning.
Tarmepitelet er dannet af et monolag af celler, der dækker fordøjelsesslimhinden ved grænsefladen med lysmiljøet. Denne position er forbundet med forskellige funktioner, såsom næringsstofabsorption og barrierefunktion, der understøttes af tilstedeværelsen af stamceller og flere differentierede epitelcelletyper (absorberende, enteroendokrine, Paneth og bægerceller)1. Udødeliggjorte cellelinjer, der traditionelt anvendes til at studere epitelceller, har store begrænsninger, da de ikke afspejler tarmepithelets cellulære kompleksitet og præsenterer genomiske abnormiteter2. Udviklingen af tredimensionelle (3D) organoider af Sato et al.3 gav en ny model til at studere tarmepitelet med en forbedret fysiologisk relevans. Faktisk er intestinale organoider afledt af ikke-transformerede stamceller, består af flere celletyper og rekapitulerer funktionaliteten af tarmepitelet. Intestinale organoider bruges i stigende grad til at forstå udviklingen og funktionerne i tarmepitelet og dets interaktioner med patogener, næringsstoffer, toksiner, lægemidler, mikrobiotaen og dets metabolitter2.
Oprindeligt udviklet til mennesker og mus, er de metoder, der anvendes til dyrkning af tarmorganoider, for nylig blevet tilpasset andre arter, herunder svin4. Gonzales et al.5 var de første til at dyrke svineorganoider fra jejunum ; Siden da er svineorganoider blevet beskrevet for andre tarmsegmenter (tolvfingertarmen, ileum og tyktarmen)6,7,8 og har vist sig at bevare en placeringsspecifik fænotype 9,10,11. Svinetarm 3D-organoider bruges nu almindeligvis til at studere effekten af næringsstoffer 12,13 eller enteriske infektioner 6,8,14.
De fleste af undersøgelserne har beskrevet kulturen af intestinale organoider startende fra frisk isolerede epitelkrypter. Dette er imidlertid ikke altid muligt af logistiske årsager, navnlig når man arbejder med store dyr som svin. Faktisk kan dyrefaciliteter til svin være placeret langt fra laboratoriet, hvor organoider dyrkes, hvilket komplicerer arbejdsorganisationen. Desuden er organoidkultur tidskrævende; Det er således ikke praktisk samtidig at dyrke flere organoide linjer, for eksempel fra forskellige tarmsegmenter eller flere dyr. For at omgå disse problemer har nogle få undersøgelser hos mennesker, heste og svin beskrevet metoder til dyrkning af organoider fra frosne tarmvæv (eller biopsier) eller fra isolerede epitelkrypter 4,15,16,17. Disse metoder tillader kryopræservering af intestinale epitelstamceller fra flere tarmsegmenter af et enkelt dyr, som derefter kan bruges til at dyrke organoider, når det er nødvendigt. Desuden giver dette mulighed for en kraftig reduktion i antallet af levende dyr, der anvendes som donorer af stamceller, da der kan oprettes store lagre af kryopræserverede krypter (principperne i 3R). En anden fordel ved denne metode er væksten af intestinale organoider kun fra dyr af interesse efter opnåelse af fænotypiske eller genotypiske resultater, hvilket er yderst omkostningseffektivt.
In vivo polariseres tarmepitelceller med den apikale side rettet mod lumen. In vitro, i 3D-organoider, vender den apikale side af epitelceller også mod lumen (dvs. inde i organoiderne)4. Denne organisation forhindrer adgang til den apikale side, hvilket er et problem, når man studerer virkningerne af luminale komponenter (fx næringsstoffer, mikrober, metabolitter) på epitelceller. For at omgå denne ulempe er der udviklet flere metoder, såsom dyrkning af organoidceller som 2D-monolag, mikroinjektion og polaritetsvending (“apikale organoider”)18,19. Kulturen af organoide cellemonolag fremstår som det mest effektive og medgørlige system. Princippet er at adskille 3D-organoider i enkeltceller og frø dem på en cellekulturbeholder, der tidligere er belagt med et tyndt lag ekstracellulær matrix (ECM)20. Under disse dyrkningsforhold vender den apikale side af epitelcellerne opad og er således tilgængelig for eksperimentelle behandlinger20. Kulturen af organoidcellemonolag blev for nylig tilpasset svinetarmen21,22; cellemonolag afledt af svin 3D-organoider er blevet brugt til flere applikationer, herunder undersøgelse af enteriske infektioner 6,23,24,25, transport af næringsstoffer9 og modellering af fordøjelsessygdomme 26.
Her præsenterer denne undersøgelse først en detaljeret protokol for dyrkning og vedligeholdelse af svins intestinale 3D-organoider afledt af kryopræserverede epitelkrypter (figur 1). Derefter beskrives en protokol for at etablere cellemonolag fra svintarm 3D-organoider. De her beskrevne metoder giver eksperimentelle værktøjer, der kan bruges til at studere grisens tarmepitel for næringsstoftransport, barrierefunktion og værtsmikroorganismeinteraktioner.
Denne protokol beskriver en metode, der anvendes til at kryopræservere epitelkrypter fra smågrisetarmen til langtidsopbevaring og efterfølgende dyrkning af 3D-organoider. Denne protokol bruger en fryseopløsning, der indeholder DMSO, FBS, Y27632 ROCK-hæmmeren, DMEM og antibiotika. En anden undersøgelse hos svin opnåede organoider fra krypter, der var kryopræserveret i en lignende fryseopløsning, men uden ROCK-hæmmeren15. Y27632 ROCK-hæmmeren blev inkluderet for at forhindre apoptose og opretholde stamcellepuljen, da epitelkryptceller efter optøning dissocieres, hvilket kan føre til celledød (‘anoikis’)27,28. Interessant nok er hesteenteroider opnået fra epitelkrypter frosset i et dyrkningsmedium, der kun indeholder DMEM og DMSO16; Denne enkle metode er endnu ikke testet for svineepitelkrypter. Andre metoder er blevet offentliggjort til dyrkning af humane og svineorganoider fra frosne væv eller biopsier i stedet for epitelkrypter 4,17. Fordelen ved denne metode er evnen til direkte at kryopræservere tarmvævene uden at udføre kryptisoleringsproceduren, hvilket kræver tid og laboratorieudstyr. Dette kan være praktisk, når vævene skal indsamles langt fra laboratoriet. Ved isolering af krypterne umiddelbart efter slagtning kan store dele af tarmen imidlertid behandles for at opnå et meget højt antal krypter, hvilket ikke er tilfældet, når man starter fra små frosne vævsfragmenter. Efter optøning af epitelkrypter blev organoider observeret fra 3-4 dage efter såning og opdelt efter 10 dage. Dette er en langsommere væksthastighed end ved start af kulturen fra friske epitelkrypter, for hvilke organoiderne blev opnået fra dag 1 efter såning og kan normalt opdeles omkring dag 511. Khalil et al. rapporterede også en forsinket vækst af svineenteroider, når de startede fra frosne krypter15, hvilket tyder på, at stamceller kan kræve tid til at genvinde deres proliferative kapacitet. Vi opnåede også et lavere antal organoider, når vi startede fra frosne krypter sammenlignet med friske krypter, hvilket kan skyldes stamcellernes død under fryseprocessen. I nogle forsøg på optøning af krypter (<20%) fik vi ikke organoider fra frosne krypter, sandsynligvis på grund af en suboptimal kryopræserveringsprocedure (f.eks. forsinket frysning efter kryptisolering på sandsynligvis mere end 1 time). Derfor anbefaler vi at holde krypterne på is, indtil de tæller, og fryse dem så hurtigt som muligt.
Til 3D-organoider valgte vi at bruge et kommercielt organoidkulturmedium formuleret til mennesker. Faktisk har tidligere rapporter vist, at svins tarmorganoider vokser effektivt med dette medium 8,11,14,19,25,26,29,30. Det er af interesse for dette dyrkningsmedium at være klar til brug og have en standardiseret koncentration af vækstfaktorer inden for en batch. Dette kulturmedium er imidlertid dyrt, dets sammensætning er ikke afsløret, og det er således ikke muligt at modulere dets sammensætning. I modsætning hertil har andre undersøgelser dyrket svinetarmorganoider i tilpassede medier indeholdende farmakologiske hæmmere, rekombinant vækstfaktor og / eller konditionerede medier 5,6,7,21. Selv om denne metode er meget fleksibel og billigere, er den tidskrævende til fremstilling af konditionerede medier og kan mangle reproducerbarhed på grund af potentiel variation i koncentrationen af vækstfaktorer i konditionerede medier. Kvaliteten af hver batch af konditionerede medier bør således valideres ved måling af organoidvækst eller markørgenekspression31.
En undersøgelse har vist, at svinejejunalorganoider dyrket i det samme kommercielle organoidkulturmedium, der anvendes her, voksede hurtigere og syntes mindre differentieret sammenlignet med enteroider dyrket med medier, der indeholdt rekombinant vækstfaktor og / eller konditionerede medier23. En høj proliferativ tilstand letter kulturen af 3D-organoider, men kan kræve inducerende differentiering for at være mere repræsentativ for intestinale fysiologiske egenskaber. I denne protokol, for passage af 3D-organoider, er cellerne fuldt dissocieret til tælling, hvilket gør det muligt at kontrollere antallet af celler podet i ECM. Dette øger reproducerbarheden af fænotypen af organoider, som er stærkt påvirket af deres densitet. Desuden undgår man at tælle cellerne for at opnå for lav eller en overfyldt kultur, der kræver tilpasning af kulturplanen. De fleste andre undersøgelser forberedte organoidfragmenter, der ikke var fuldt dissocieret til enkeltceller, og anvendte et fortyndingsforhold til passering. Denne metode er mere ligetil, men kan fremkalde variabilitet i henhold til kulturens organoidtæthed.
Til kulturen i monolag podes organoidceller i kulturindsatser, der er forbelagt med et tyndt lag ECM, der tillader fastgørelse af celler, men undgår vækst af organoider i 3D. Denne protokol anvendte kollagen type IV som et ECM-protein, som beskrevet tidligere hos svin23. Andre undersøgelser med svineorganoide monolag brugte den samme tumorafledte ECM, der blev brugt her, til dyrkning af 3D-organoider 6,8,9,21,25,30. Fordelen ved at anvende kollagen er evnen til at standardisere proteinkoncentrationen med en fuldt defineret sammensætning, hvilket ikke er tilfældet i den tumorafledte ECM. Et kritisk skridt for succesen med kulturen af cellemonolag er at være opmærksom på det visuelle udseende af forløberen 3D-organoider, som skal have veldefinerede kanter og et tomt lumen uden sort affald. Faktisk er organoider med et højt modningsniveau og en lav proliferativ hastighed ikke en passende kilde til celler til 2D-kultur. Således er tidspunktet for dissociation af 3D-organoider i enkeltceller afgørende for succesen med dette trin.
Kulturen af 2D-monolag fra enkeltceller tillader standardisering af antallet af frøede celler, hvilket er vanskeligere, når man starter fra organoidfragmenter, som udført i nogle andre metoder. Vi såede 7,6 x 10 5 celler pr. cm 2, hvilket er højt sammenlignet med de fleste andre undersøgelser 21,22,23 hos svin, der brugte en lavere celletæthed, der spænder fra0,25 x 10 5 celler pr. cm 2 til 1,78 x 10 5 celler pr. cm 2. Kravet om et stort antal organoidceller udgør en begrænsning af denne protokol, men det tillod os hurtigt at opnå et sammenflydende monolag, der fuldt ud dækker kulturindsatsen efter 1 dag. I modsætning hertil opnåede Vermeire et al.23 sammenløb efter 4-7 dage med en lavere tæthed af celler podet (fra 0,25 x 10 5 celler / cm 2 til 0,4 x 105 celler /cm 2). Nogle undersøgelser har også brugt svineorganoidcellemonolag, der ikke fuldt ud dækkede dyrkningsoverfladen for infektioner med vira 8,30. Under disse forhold er den apikale side af epitelceller tilgængelig til behandlinger, men fuldt sammenflydende monolag er påkrævet, hvis målet er at studere næringsstofabsorption eller epitelpermeabilitet.
Til organoidcellemonolag blev der anvendt et kommercielt organoidkulturmedium suppleret med 20% FBS, baseret på en nylig undersøgelse af bovin enteroidafledte monolag32. I vores test var tilskuddet med 20% FBS nødvendigt for at opnå fuldt sammenflydende monolag, sandsynligvis på grund af et højt vækstfaktorkrav. Tværtimod har andre undersøgelser, der bruger det samme kommercielle medium, etableret monolag uden yderligere FBS 8,25,30, men uden at nå fuld sammenløb. Andre undersøgelser har også brugt tilskud med 20% FBS i et tilpasset medium til dyrkning af svineorganoidcellemonolag21,22. I vores eksperimenter er TEER høj 1 dag efter såning (ca. 700 Ω·cm 2) og forbliver høj indtil dag 3 (ca. 1.500 Ω·cm2; dette er i overensstemmelse med dannelsen af tætte kryds, som indikeret ved ekspressionen af okklusion. Van der Hee et al. opnåede lignende TEER-værdier over 72 timer for jejunum organoidcellemonolag21. De viste også, at monolag kan opretholdes indtil dag 12-15 med daglige medieændringer. I modsætning hertil har andre undersøgelser rapporteret meget lavere TEER-værdier (ca. 200 Ω·cm2) for svineorganoidcellemonolag 6,22. Disse forskelle mellem undersøgelser kan være relateret til det undersøgte tarmsegment eller til de anvendte medier, der påvirker epiteldifferentiering.
Afslutningsvis letter ovennævnte protokol til dyrkning af svineintestinale 3D-organoider fra frosne epitelkrypter tilrettelæggelsen af kulturarbejdet. Det reducerer behovet for frisk væv, der skal opnås fra levende dyr. Vi forklarer også, hvordan man etablerer fuldt sammenflydende cellemonolag afledt af svineorganoider på mindre end 3 dage. Således kan vores protokoller være nyttige ressourcer for forskere, der studerer svinets tarmepitel til veterinær eller biomedicinsk forskning.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Institut Carnot France Futur Elevage (“OrganoPig” -projektet) og af INRAE HOLOFLUX (“Holopig” -projektet). Forfatterne er taknemmelige for Genotoul kernefaciliteter (TRI). Vi anerkender Christelle Knudsen (GenPhySE, INRAE, Toulouse) for omhyggelig korrekturlæsning.
0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | Store at room temperature. |
15 mL conical tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
24-well cell culture plate | Corning | 003526 | |
48-well cell culture plate | Corning | 003548 | |
50 mL polypropylene conical tube | Falcon | 352070 | |
Bovine Serum Albumine (BSA) | Euromedex | A6003 | Store at 4 °C. |
Centrifuge Universal 320 R | Hettich | 1406 | |
Collagene type IV from human placenta | Sigma | C5533 | Prepare the stock solution at 1 mg/mL in acetic acid according to the manufacturer's recommendation. Aliquot (500 µL) and store at -20 °C. |
CoolCell LX Cell Freezing Container | Corning | 432003 | Used to cryopreserve crypts and organoids. |
Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | 16842556 | |
Coverslips, 22 mm x 50 mm | VWR | 630-1845 | |
Cryotube ClearLine 1 mL | Clear line | 390706 | Used to cryopreserve crypts and organoids. |
DAPI | Invitrogen | D1306 | Prepare the stock solution at 5 mg/mL in water according to the manufacturer’s recommendation. Aliquot (20 µL) and store at -20 °C |
Dithiothreitol (DTT) | Merck | 10197777001 | Store at 4 °C. |
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 31966047 | Store at 4 °C. |
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Corning | 25-950-CQC | Store at room temperature. |
Epredia Superfrost Plus Adhesion microscopic slide | VWR | 631-9483 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | Store 5 mL aliquots at -20 °C. |
Fisherbrand Sterile Cell Strainers | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | Used for crypt isolation. |
Fixed Tilt 3D Platform Rotator | VWR | 97025-564 | Used for incubations in the immunostaining protocol. |
Gibco PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010015 | Store at 4 °C. |
Gibco TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12605-010 | Enzyme dissociation reagent. Store at room temperature. |
Goat anti-rabbit IgG, Alexa fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | Secondary antibody. Store at 4 °C. Working dilution 1:1000. |
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | Stem Cell Technology | 6010 | Organoid culture medium. Store at -20 °C. Thaw the basal medium and organoid supplement at room temperature and mix (1:1). Store the mix at 4 °C for up to 1 week. |
Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells | Corning | 353095 | |
Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS2 | |
Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | Tumor-derived extracellular matrix used for the 3D culture of organoids. Matrigel polymerizes at room temperature. Use cooled tips to pipet the Matrigel. Prepare 500 µL aliquots and store at -20 °C. |
Mounting medium for fluorescence with DAPI | Vectashield | H1250 | Store at 4 °C. |
Occludin polyclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | 71-1500 | Primary antibody. Store at -20 °C. Working dilution 1:200. |
Paraformaldehyde 32% | Electron microscopy science | 15714 | Prepare 4% paraformaldehyde (PFA) solution under chemical hood by adding 5 mL of 32% PFA to 35 mL of PBS. Aliquot by 10 mL and store at -20 °C. |
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | Antibacterial. Store 5 mL aliquots at -20 °C. |
Phalloidin TRITC | Sigma | P1951 | Probe for actin staining. 1 mg/mL stock solution. Store at 4 °C. |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-05 | Antimicrobial agent for primary cells acting on bacteria, mycoplasma and fungi. Store at -20 °C. |
ROCK Inhibitor (Y27632) | ATCC | ACS-3030 | Used to maintain the stem cells. Prepare the stock solution at 10 mM in sterile water according to the manufacturer's recommendation and store aliquots (50 µL) at -20 °C. |
Rotating shaker mix XL | Clear line | 062646CL | Used for crypt isolation. |
Stripette Serological Pipets 10 mL | Corning | 4488 | |
Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
Triton X100 | Sigma | 8787 | Store at room temperature. |
Trypan Blue stain 0.4% | Thermo Fisher Scientific | T10282 | Store at room temperature. |
Vacuum system Vacusip | Integra | 159000 | Used to remove the medium of organoid wells. |