यहां, हम क्रायोप्रिजर्व्ड एपिथेलियल क्रिप्ट्स से सुअर आंतों के 3 डी ऑर्गेनोइड्स को कल्चर करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम 3 डी ऑर्गेनोइड्स से प्राप्त सेल मोनोलेयर स्थापित करने के लिए एक विधि का भी वर्णन करते हैं, जिससे उपकला कोशिकाओं के एपिकल पक्ष तक पहुंच की अनुमति मिलती है।
आंतों के ऑर्गेनोइड्स का उपयोग पाचन रोग मॉडलिंग के लिए आंत उपकला का अध्ययन करने के लिए, या दवाओं, पोषक तत्वों, मेटाबोलाइट्स, रोगजनकों और माइक्रोबायोटा के साथ बातचीत की जांच करने के लिए किया जा रहा है। आंतों के ऑर्गेनोइड्स को कल्चर करने के तरीके अब सूअरों सहित कई प्रजातियों के लिए उपलब्ध हैं, जो एक खेत जानवर के रूप में और मनुष्यों के लिए एक ट्रांसलेशनल मॉडल के रूप में प्रमुख रुचि की एक प्रजाति है, उदाहरण के लिए, जूनोटिक रोगों का अध्ययन करने के लिए। यहां, हम जमे हुए उपकला क्रिप्ट से सुअर आंतों के 3 डी ऑर्गेनोइड्स को कल्चर करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रक्रिया का गहन विवरण देते हैं। प्रोटोकॉल बताता है कि सुअर की आंत से उपकला क्रिप्ट्स को कैसे क्रायोप्रिजर्व किया जाए और 3 डी आंतों के ऑर्गेनोइड्स को कल्चर करने के लिए बाद की प्रक्रियाएं। इस पद्धति के मुख्य लाभ हैं (i) 3 डी ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति से क्रिप्ट्स के अलगाव का अस्थायी पृथक्करण, (ii) कई आंतों के खंडों और कई जानवरों से एक साथ प्राप्त क्रायोसंरक्षित क्रिप्ट्स के बड़े स्टॉक की तैयारी, और इस प्रकार (iii) जीवित जानवरों से ताजा ऊतकों का नमूना लेने की आवश्यकता में कमी। हम उपकला कोशिकाओं के एपिकल पक्ष तक पहुंच की अनुमति देने के लिए 3 डी ऑर्गेनोइड्स से प्राप्त सेल मोनोलेयर स्थापित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का भी विस्तार करते हैं, जो पोषक तत्वों, रोगाणुओं या दवाओं के साथ बातचीत की साइट है। कुल मिलाकर, यहां वर्णित प्रोटोकॉल पशु चिकित्सा और जैव चिकित्सा अनुसंधान में सुअर आंतों के उपकला का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी संसाधन है।
आंतों के उपकला का निर्माण ल्यूमिनल वातावरण के साथ इंटरफ़ेस पर पाचन श्लेष्म को कवर करने वाली कोशिकाओं के एक मोनोलेयर द्वारा किया जाता है। यह स्थिति पोषक तत्व अवशोषण और बाधा समारोह जैसे विविध कार्यों से जुड़ी हुई है, जो स्टेम कोशिकाओं और कई विभेदित उपकला कोशिका प्रकारों (अवशोषक, एंटरोएंडोक्राइन, पनेथ और गोब्लेट कोशिकाओं) की उपस्थिति द्वारा समर्थित हैं। पारंपरिक रूप से उपकला कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली अमर कोशिका लाइनों की प्रमुख सीमाएं हैं, क्योंकि वे आंतों के उपकला की सेलुलर जटिलता को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं औरजीनोमिक असामान्यताएं प्रस्तुत करते हैं। सातो एट अल.3 द्वारा त्रि-आयामी (3 डी) ऑर्गेनोइड्स के विकास ने आंतों के उपकला का अध्ययन करने के लिए एक नया मॉडल प्रदान किया, जिसमें एक बेहतर शारीरिक प्रासंगिकता थी। दरअसल, आंतों के ऑर्गेनोइड गैर-रूपांतरित स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त होते हैं, कई सेल प्रकारों से बने होते हैं, और आंतों के उपकला की कार्यक्षमता को पुन: उत्पन्न करते हैं। आंतों के ऑर्गेनोइड्स का उपयोग आंतों के उपकला के विकास और कार्यों और रोगजनकों, पोषक तत्वों, विषाक्त पदार्थों, दवाओं, माइक्रोबायोटा और इसके मेटाबोलाइट्सके साथ इसकी बातचीत को समझने के लिए किया जा रहा है।
प्रारंभ में मनुष्यों और चूहों के लिए विकसित, आंतों के ऑर्गेनोइड्स को कल्चर करने के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीकों को हाल हीमें सूअरों सहित अन्य प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया गया है। गोंजालेस एट अल.5 जेजुनम से सुअर ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति करने वाले पहले व्यक्ति थे; तब से, पोर्सिन ऑर्गेनोइड्स को अन्य आंत खंडों (ग्रहणी, इलियम और बृहदान्त्र) 6,7,8 के लिए वर्णित किया गया है, और एक स्थान-विशिष्ट फेनोटाइप 9,10,11 को बनाए रखने के लिए दिखाया गया है। सुअर आंतों 3 डी ऑर्गेनोइड्स का उपयोग अब आमतौर पर पोषक तत्वों12,13 या एंटरिक संक्रमण 6,8,14 के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया जाता है।
अधिकांश अध्ययनों ने ताजा पृथक उपकला क्रिप्ट्स से शुरू होने वाले आंतों के ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति का वर्णन किया है। हालांकि, यह हमेशा तार्किक कारणों से संभव नहीं होता है, विशेष रूप से सूअरों जैसे बड़े जानवरों के साथ काम करते समय। दरअसल, सूअरों के लिए पशु सुविधाएं प्रयोगशाला से दूर स्थित हो सकती हैं जहां ऑर्गेनोइड सुसंस्कृत होते हैं, जो कार्य संगठन को जटिल बनाता है। इसके अलावा, ऑर्गेनॉइड संस्कृति समय लेने वाली है; इस प्रकार, एक साथ कई ऑर्गेनॉइड लाइनों को विकसित करना व्यावहारिक नहीं है, उदाहरण के लिए, विभिन्न आंत खंडों या कई जानवरों से। इन मुद्दों को दरकिनार करने के लिए, मनुष्यों, घोड़ों और सूअरों में कुछ अध्ययनों ने जमे हुए आंतों के ऊतकों (या बायोप्सी) या पृथक उपकला क्रिप्ट 4,15,16,17 से ऑर्गेनोइड्स को कल्चर करने के तरीकों का वर्णन किया है। ये विधियां एक ही जानवर के कई आंत खंडों से आंतों के उपकला स्टेम कोशिकाओं के क्रायोप्रिजर्वेशन की अनुमति देती हैं, जिसका उपयोग तब आवश्यकता होने पर ऑर्गेनोइड्स को विकसित करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, यह स्टेम कोशिकाओं के दाताओं के रूप में उपयोग किए जाने वाले जीवित जानवरों की संख्या में एक मजबूत कमी की अनुमति देता है, क्योंकि क्रायोप्रिजर्व्ड क्रिप्ट्स के बड़े स्टॉक बनाए जा सकते हैं (3 आर के सिद्धांत)। इस विधि का एक और लाभ फेनोटाइपिक या जीनोटाइपिक परिणाम प्राप्त करने के बाद केवल रुचि के जानवरों से आंतों के ऑर्गेनोइड्स का विकास है, जो अत्यधिक लागत प्रभावी है।
विवो में, आंतों के उपकला कोशिकाओं को ध्रुवीकृत किया जाता है, जिसमें एपिकल पक्ष लुमेन की ओर निर्देशित होता है। विट्रो में, 3 डी ऑर्गेनोइड्स में, उपकला कोशिकाओं का एपिकल पक्ष भी लुमेन (यानी, ऑर्गेनोइड्स के अंदर) का सामना कर रहा है। यह संगठन एपिकल पक्ष तक पहुंच को रोकता है, जो उपकला कोशिकाओं पर ल्यूमिनल घटकों (जैसे, पोषक तत्वों, रोगाणुओं, मेटाबोलाइट्स) के प्रभावों का अध्ययन करते समय एक मुद्दा है। इस नुकसान को दरकिनार करने के लिए, कई तरीकों को विकसित किया गया है, जैसे कि 2 डी मोनोलेयर, माइक्रोइंजेक्शन और पोलैरिटी रिवर्सल (“एपिकल-आउट ऑर्गेनोइड्स”) 18,19 के रूप में ऑर्गेनॉइड कोशिकाओं की संस्कृति। ऑर्गेनॉइड सेल मोनोलेयर की संस्कृति सबसे कुशल और वापस लेने योग्य प्रणाली के रूप में उभर रही है। सिद्धांत 3 डी ऑर्गेनोइड्स को एकल कोशिकाओं में अलग करना है और उन्हें एक सेल कल्चर पोत पर बीज देना है जो पहले बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) 20 की एक पतली परत के साथ लेपित था। इन संस्कृति स्थितियों में, उपकला कोशिकाओं का एपिकल पक्ष ऊपर की ओर है, और इस प्रकार प्रयोगात्मक उपचार20 के लिए सुलभ है। ऑर्गेनॉइड सेल मोनोलेयर की संस्कृति को हाल ही में सुअर आंत21,22 के लिए अनुकूलित किया गया था; सुअर 3 डी ऑर्गेनोइड्स से प्राप्त सेल मोनोलेयर का उपयोग कई अनुप्रयोगों के लिए किया गया है, जिसमें एंटरिक संक्रमण 6,23,24,25, पोषक तत्वों का परिवहन9, और पाचन रोग मॉडलिंग26 शामिल हैं।
यहां, यह अध्ययन पहले क्रायोप्रिजर्व्ड एपिथेलियल क्रिप्ट्स (चित्रा 1) से प्राप्त सुअर आंतों के 3 डी ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति और रखरखाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। फिर, सुअर आंतों के 3 डी ऑर्गेनोइड्स से सेल मोनोलेयर स्थापित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। यहां वर्णित विधियां प्रयोगात्मक उपकरण प्रदान करती हैं जिनका उपयोग पोषक तत्व परिवहन, बाधा समारोह और मेजबान-सूक्ष्मजीव इंटरैक्शन के लिए सुअर आंतों के उपकला का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल लंबे समय तक भंडारण और 3 डी ऑर्गेनोइड्स की बाद की संस्कृति के लिए पिगलेट आंत से उपकला क्रिप्ट को क्रायोप्रिजर्व करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधि का वर्णन करता है। यह प्रोटोकॉल डीएमएसओ, एफबीएस, वाई 27632 रॉक अवरोधक, डीएमईएम और एंटीबायोटिक दवाओं वाले फ्रीजिंग समाधान का उपयोग करता है। सूअरों में एक अन्य अध्ययन ने क्रिप्ट्स क्रायोप्रिजर्व से ऑर्गेनोइड प्राप्त किए, जो एक समान ठंड समाधान में संरक्षित थे लेकिन रॉक अवरोधक15 के बिना। वाई 27632 रॉक अवरोधक को एपोप्टोसिस को रोकने और स्टेम सेल पूल को बनाए रखने के लिए शामिल किया गया था, क्योंकि पिघलने के बाद, उपकला क्रिप्ट कोशिकाओं को अलग कर दिया जाता है, जिससे कोशिका मृत्यु (‘एनोइकिस’) 27,28 हो सकती है। दिलचस्प बात यह है कि इक्वाइन एंटरोइड्स को केवल डीएमईएम और डीएमएसओ16 युक्त संस्कृति माध्यम में जमे उपकला क्रिप्ट से प्राप्त किया गया है; इस सरल विधि का अभी तक सुअर उपकला क्रिप्ट के लिए परीक्षण नहीं किया गया है। उपकला क्रिप्ट 4,17 के बजाय जमे हुए ऊतकों या बायोप्सी से मानव और सुअर ऑर्गेनोइड विकसित करने के लिए अन्य तरीकों को प्रकाशित किया गया है। इस विधि का लाभ क्रिप्ट अलगाव प्रक्रिया किए बिना आंतों के ऊतकों को सीधे क्रायोप्रिजर्व करने की क्षमता है, जिसके लिए समय और प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता होती है। यह सुविधाजनक हो सकता है जब ऊतकों को प्रयोगशाला से दूर एकत्र किया जाना चाहिए। हालांकि, वध के तुरंत बाद क्रिप्ट्स को अलग करते समय, आंत के बड़े खंडों को बहुत अधिक संख्या में क्रिप्ट प्राप्त करने के लिए संसाधित किया जा सकता है, जो कि छोटे जमे हुए ऊतक टुकड़ों से शुरू करते समय ऐसा नहीं होता है। एपिथेलियल क्रिप्ट्स के पिघलने के बाद, ऑर्गेनोइड्स को सीडिंग के 3-4 दिनों के बाद देखा गया और 10 दिनों के बाद विभाजित किया गया। यह ताजा उपकला क्रिप्ट्स से संस्कृति शुरू करते समय की तुलना में धीमी वृद्धि दर है, जिसके लिए ऑर्गेनोइड्स को बीजारोपण के बाद दिन 1 से प्राप्त किया गया था, और आमतौर पर लगभग 511 वें दिन विभाजित किया जा सकता है। खलील एट अल ने जमे हुए क्रिप्ट्स15 से शुरू होने पर सुअर एंटरोइड्स के विलंबित विकास की भी सूचना दी, यह सुझाव देते हुए कि स्टेम कोशिकाओं को अपनी प्रोलिफेरेटिव क्षमता को ठीक करने के लिए समय की आवश्यकता हो सकती है। हमने ताजा क्रिप्ट्स की तुलना में जमे हुए क्रिप्ट्स से शुरू होने पर ऑर्गेनोइड्स की कम संख्या भी प्राप्त की, जो ठंड प्रक्रिया के दौरान स्टेम कोशिकाओं की मृत्यु के कारण हो सकता है। क्रिप्ट्स पिघलने (<20%) के कुछ प्रयासों में, हमने जमे हुए क्रिप्ट्स से ऑर्गेनोइड प्राप्त नहीं किए, शायद एक सबऑप्टिमल क्रायोप्रिजर्वेशन प्रक्रिया के कारण (उदाहरण के लिए, क्रिप्ट अलगाव के बाद ठंड में देरी)। इस प्रकार, हम गिनती तक क्रिप्ट्स को बर्फ पर रखने की सलाह देते हैं, और जितनी जल्दी हो सके उन्हें फ्रीज करते हैं।
3 डी ऑर्गेनोइड्स के लिए, हमने मनुष्यों के लिए तैयार किए गए एक वाणिज्यिक ऑर्गेनॉइड संस्कृति माध्यम का उपयोग करना चुना। दरअसल, पिछली रिपोर्टों से पता चला है कि सुअर आंतों के ऑर्गेनोइड इस माध्यम 8,11,14,19,25,26,29,30 के साथ कुशलता से बढ़ते हैं। इस संस्कृति माध्यम के लिए उपयोग के लिए तैयार होना और एक बैच के भीतर विकास कारकों की एक मानकीकृत एकाग्रता होना दिलचस्प है। हालांकि, यह संस्कृति माध्यम महंगा है, इसकी संरचना अज्ञात है, और इस प्रकार इसकी संरचना को संशोधित करना संभव नहीं है। इसके विपरीत, अन्य अध्ययनों ने फार्माकोलॉजिकल इनहिबिटर, पुनः संयोजक विकास कारक और / या वातानुकूलित मीडिया 5,6,7,21 युक्त अनुकूलित मीडिया में सुअर आंतों के ऑर्गेनोइड्स को सुसंस्कृत किया है। हालांकि अत्यधिक लचीला और सस्ता, यह विधि वातानुकूलित मीडिया के उत्पादन के लिए समय लेने वाली है और वातानुकूलित मीडिया में विकास कारकों की एकाग्रता में संभावित परिवर्तनशीलता के कारण प्रजनन क्षमता की कमी हो सकती है। इस प्रकार, वातानुकूलित मीडिया के प्रत्येक बैच की गुणवत्ता को ऑर्गेनोइड विकास या मार्कर जीन अभिव्यक्ति31 को मापकर मान्य किया जाना चाहिए।
एक अध्ययन से पता चला है कि यहां उपयोग किए जाने वाले एक ही वाणिज्यिक ऑर्गेनॉइड कल्चर माध्यम में संवर्धित पिग जेजुनल ऑर्गेनोइड तेजी से बढ़े और कम विभेदित लग रहे थे, जबकि पुनः संयोजक विकास कारक और / या वातानुकूलित मीडिया23 वाले मीडिया के साथ संवर्धित एंटरोइड्स की तुलना में। एक उच्च प्रोलिफेरेटिव अवस्था 3 डी ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति की सुविधा प्रदान करती है, लेकिन आंतों की शारीरिक विशेषताओं के अधिक प्रतिनिधि होने के लिए भेदभाव को प्रेरित करने की आवश्यकता हो सकती है। इस प्रोटोकॉल में, 3 डी ऑर्गेनोइड्स के पारित होने के लिए, कोशिकाओं को गिनती के लिए पूरी तरह से अलग कर दिया जाता है, जिससे ईसीएम में बीजित कोशिकाओं की संख्या को नियंत्रित करने की अनुमति मिलती है। यह ऑर्गेनोइड्स के फेनोटाइप की प्रजनन क्षमता को बढ़ाता है, जो उनके घनत्व से अत्यधिक प्रभावित होता है। इसके अलावा, कोशिकाओं की गिनती बहुत कम या भीड़भाड़ वाली संस्कृति प्राप्त करने से बचती है, जिसके लिए संस्कृति अनुसूची को अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है। अधिकांश अन्य अध्ययनों ने ऑर्गेनॉइड टुकड़े तैयार किए जो एकल कोशिकाओं से पूरी तरह से अलग नहीं थे, और पासिंग के लिए कमजोर पड़ने वाले अनुपात का उपयोग किया। यह विधि अधिक सरल है, लेकिन संस्कृति के ऑर्गेनॉइड घनत्व के अनुसार परिवर्तनशीलता को प्रेरित कर सकती है।
मोनोलेयर में संस्कृति के लिए, ऑर्गेनोइड कोशिकाओं को संस्कृति में बीज दिया जाता है, जो ईसीएम की एक पतली परत के साथ प्रीकोटेड होता है, जो कोशिकाओं के लगाव की अनुमति देता है लेकिन 3 डी में ऑर्गेनोइड के विकास से बचता है। इस प्रोटोकॉल ने कोलेजन टाइप IV को ईसीएम प्रोटीन के रूप में इस्तेमाल किया, जैसा कि पहलेसूअरों 23 में वर्णित है। सुअर ऑर्गेनॉइड मोनोलेयर के साथ अन्य अध्ययनों ने 3 डी ऑर्गेनोइड्स 6,8,9,21,25,30 को कल्चर करने के लिए यहां उपयोग किए जाने वाले उसी ट्यूमर-व्युत्पन्न ईसीएम का उपयोग किया। कोलेजन का उपयोग करने का लाभ पूरी तरह से परिभाषित संरचना के साथ प्रोटीन एकाग्रता को मानकीकृत करने की क्षमता है, जो ट्यूमर-व्युत्पन्न ईसीएम में नहीं है। सेल मोनोलेयर की संस्कृति की सफलता के लिए एक महत्वपूर्ण कदम अग्रदूत 3 डी ऑर्गेनोइड्स की दृश्य उपस्थिति पर ध्यान देना है, जिसमें अच्छी तरह से परिभाषित किनारे और काले मलबे के बिना एक खाली लुमेन होना चाहिए। दरअसल, उच्च परिपक्वता स्तर और कम प्रोलिफेरेटिव दर वाले ऑर्गेनोइड 2 डी संस्कृति के लिए कोशिकाओं का उपयुक्त स्रोत नहीं हैं। इस प्रकार, एकल कोशिकाओं में 3 डी ऑर्गेनोइड्स के पृथक्करण का समय इस कदम की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है।
एकल कोशिकाओं से 2 डी मोनोलेयर की संस्कृति बीजित कोशिकाओं की संख्या को मानकीकृत करने की अनुमति देती है, जो ऑर्गेनॉइड टुकड़ों से शुरू करते समय अधिक कठिन होती है, जैसा कि कुछ अन्य तरीकों में किया जाता है। हमने प्रति सेमी2 में 7.6 x 105 कोशिकाओं को बीज दिया, जोसूअरों में 21,22,23 अन्य अध्ययनों की तुलना में अधिक है, जो कम सेल घनत्व का उपयोग करते थे, जो 0.25 x 105 कोशिकाओं प्रति सेमी2 से 1.78 x 105 कोशिकाओं प्रति सेमी2 तक होता है। ऑर्गेनॉइड कोशिकाओं की एक उच्च संख्या की आवश्यकता इस प्रोटोकॉल की एक सीमा का गठन करती है, लेकिन इसने हमें 1 दिन के बाद कल्चर इंसर्ट को पूरी तरह से कवर करते हुए जल्दी से एक कॉन्फ्लुएंट मोनोलेयर प्राप्त करने की अनुमति दी। इसके विपरीत, वर्मीयर एट अल.23 ने 4-7 दिनों के बाद बीजित कोशिकाओं के कम घनत्व (0.25 x 105 कोशिकाओं / सेमी2 से 0.4 x 105 कोशिकाओं / सेमी2 तक) के साथ संयोजन प्राप्त किया। कुछ अध्ययनों ने सुअर ऑर्गेनॉइड सेल मोनोलेयर का भी उपयोग किया है जो वायरस 8,30 के साथ संक्रमण के लिए संस्कृति की सतहको पूरी तरह से कवर नहीं करते हैं। इन स्थितियों में, उपकला कोशिकाओं का एपिकल पक्ष उपचार के लिए सुलभ है, लेकिन यदि उद्देश्य पोषक तत्व अवशोषण या उपकला पारगम्यता का अध्ययन करना है तो पूरी तरह से कॉन्फ्लुएंट मोनोलेयर की आवश्यकता होती है।
ऑर्गेनोइड सेल मोनोलेयर के लिए, 20% एफबीएस के साथ पूरक एक वाणिज्यिक ऑर्गेनॉइड कल्चर माध्यम का उपयोग किया गया था, जो गोजातीय एंटरोइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर32 पर हाल के अध्ययन पर आधारित था। हमारे परीक्षणों में, 20% एफबीएस के साथ पूरक पूरी तरह से कॉन्फ्लुएंट मोनोलेयर प्राप्त करने के लिए आवश्यक था, शायद उच्च विकास कारक की आवश्यकता के कारण। इसके विपरीत, एक ही वाणिज्यिक माध्यम का उपयोग करने वाले अन्य अध्ययनों ने अतिरिक्त एफबीएस 8,25,30 के बिना मोनोलेयर स्थापित किए हैं, लेकिन पूर्ण सामंजस्य तक पहुंचने के बिना। अन्य अध्ययनों ने सुअर ऑर्गेनॉइड सेल मोनोलेयर 21,22 की संस्कृति के लिए एक अनुकूलित माध्यम में20% एफबीएस के साथ पूरक का भी उपयोग किया है। हमारे प्रयोगों में, टीईआर बीजारोपण के 1 दिन बाद उच्च होता है (लगभग 700 Ω सेमी2), और दिन 3 तक उच्च रहता है (लगभग 1,500 Ω सेमी2; यह तंग जंक्शनों के गठन के अनुरूप है, जैसा कि ऑक्लुडिन की अभिव्यक्ति से संकेत मिलता है। वैन डेर ही एट अल ने जेजुनम ऑर्गेनॉइड सेल मोनोलेयर21 के लिए 72 घंटे से अधिक समान टीईआर मान प्राप्त किए। उन्होंने यह भी दिखाया कि मोनोलेयर को दैनिक मीडिया परिवर्तनों के साथ 12-15 दिन तक बनाए रखा जा सकता है। इसके विपरीत, अन्य अध्ययनों ने सुअर ऑर्गेनॉइड सेल मोनोलेयर 6,22 के लिए बहुत कम टीईआर मान (लगभग200 Ω सेमी 2) की सूचना दी है। अध्ययनों के बीच ये अंतर अध्ययन किए गए आंत खंड या उपकला भेदभाव को प्रभावित करने वाले मीडिया से संबंधित हो सकते हैं।
अंत में, जमे हुए उपकला क्रिप्ट्स से सुअर आंतों के 3 डी ऑर्गेनोइड्स को विकसित करने के लिए उपरोक्त प्रोटोकॉल संस्कृति कार्य के संगठन की सुविधा प्रदान करता है। यह जीवित जानवरों से प्राप्त किए जाने वाले ताजा ऊतकों की आवश्यकता को कम करता है। हम यह भी बताते हैं कि 3 दिनों से कम समय में सुअर ऑर्गेनोइड्स से प्राप्त पूरी तरह से कंफ्लुएंट सेल मोनोलेयर कैसे स्थापित किए जाएं। इस प्रकार, हमारे प्रोटोकॉल पशु चिकित्सा या जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए सुअर आंतों के उपकला का अध्ययन करने वाले वैज्ञानिकों के लिए उपयोगी संसाधन हो सकते हैं।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को इंस्टीट्यूट कार्नोट फ्रांस फ्यूचर एलीवेज (“ऑर्गेनोपिग” परियोजना) और INRAE HOLOFLUX (“होलोपिग” परियोजना) द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक जीनोटौल कोर सुविधाओं (टीआरआई) के आभारी हैं। हम सावधानीपूर्वक प्रूफरीडिंग के लिए क्रिस्टेल नुडसेन (जेनफिज़, आईएनआरएई, टूलूज़) को स्वीकार करते हैं।
0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | Store at room temperature. |
15 mL conical tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
24-well cell culture plate | Corning | 003526 | |
48-well cell culture plate | Corning | 003548 | |
50 mL polypropylene conical tube | Falcon | 352070 | |
Bovine Serum Albumine (BSA) | Euromedex | A6003 | Store at 4 °C. |
Centrifuge Universal 320 R | Hettich | 1406 | |
Collagene type IV from human placenta | Sigma | C5533 | Prepare the stock solution at 1 mg/mL in acetic acid according to the manufacturer's recommendation. Aliquot (500 µL) and store at -20 °C. |
CoolCell LX Cell Freezing Container | Corning | 432003 | Used to cryopreserve crypts and organoids. |
Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | 16842556 | |
Coverslips, 22 mm x 50 mm | VWR | 630-1845 | |
Cryotube ClearLine 1 mL | Clear line | 390706 | Used to cryopreserve crypts and organoids. |
DAPI | Invitrogen | D1306 | Prepare the stock solution at 5 mg/mL in water according to the manufacturer’s recommendation. Aliquot (20 µL) and store at -20 °C |
Dithiothreitol (DTT) | Merck | 10197777001 | Store at 4 °C. |
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 31966047 | Store at 4 °C. |
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Corning | 25-950-CQC | Store at room temperature. |
Epredia Superfrost Plus Adhesion microscopic slide | VWR | 631-9483 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | Store 5 mL aliquots at -20 °C. |
Fisherbrand Sterile Cell Strainers | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | Used for crypt isolation. |
Fixed Tilt 3D Platform Rotator | VWR | 97025-564 | Used for incubations in the immunostaining protocol. |
Gibco PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010015 | Store at 4 °C. |
Gibco TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12605-010 | Enzyme dissociation reagent. Store at room temperature. |
Goat anti-rabbit IgG, Alexa fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | Secondary antibody. Store at 4 °C. Working dilution 1:1000. |
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | Stem Cell Technology | 6010 | Organoid culture medium. Store at -20 °C. Thaw the basal medium and organoid supplement at room temperature and mix (1:1). Store the mix at 4 °C for up to 1 week. |
Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells | Corning | 353095 | |
Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS2 | |
Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | Tumor-derived extracellular matrix used for the 3D culture of organoids. Matrigel polymerizes at room temperature. Use cooled tips to pipet the Matrigel. Prepare 500 µL aliquots and store at -20 °C. |
Mounting medium for fluorescence with DAPI | Vectashield | H1250 | Store at 4 °C. |
Occludin polyclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | 71-1500 | Primary antibody. Store at -20 °C. Working dilution 1:200. |
Paraformaldehyde 32% | Electron microscopy science | 15714 | Prepare 4% paraformaldehyde (PFA) solution under chemical hood by adding 5 mL of 32% PFA to 35 mL of PBS. Aliquot by 10 mL and store at -20 °C. |
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | Antibacterial. Store 5 mL aliquots at -20 °C. |
Phalloidin TRITC | Sigma | P1951 | Probe for actin staining. 1 mg/mL stock solution. Store at 4 °C. |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-05 | Antimicrobial agent for primary cells acting on bacteria, mycoplasma and fungi. Store at -20 °C. |
ROCK Inhibitor (Y27632) | ATCC | ACS-3030 | Used to maintain the stem cells. Prepare the stock solution at 10 mM in sterile water according to the manufacturer's recommendation and store aliquots (50 µL) at -20 °C. |
Rotating shaker mix XL | Clear line | 062646CL | Used for crypt isolation. |
Stripette Serological Pipets 10 mL | Corning | 4488 | |
Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
Triton X100 | Sigma | 8787 | Store at room temperature. |
Trypan Blue stain 0.4% | Thermo Fisher Scientific | T10282 | Store at room temperature. |
Vacuum system Vacusip | Integra | 159000 | Used to remove the medium of organoid wells. |