Här beskriver vi ett protokoll för att odla gristarm 3D-organoider från kryokonserverade epitelkrypter. Vi beskriver också en metod för att etablera cellmonolager härledda från 3D-organoider, vilket möjliggör åtkomst till den apikala sidan av epitelceller.
Intestinala organoider används alltmer för att studera tarmepitelet för modellering av matsmältningssjukdomar, eller för att undersöka interaktioner med läkemedel, näringsämnen, metaboliter, patogener och mikrobiotan. Metoder för att odla tarmorganoider finns nu tillgängliga för flera arter, inklusive grisar, vilket är en art av stort intresse både som husdjur och som en translationell modell för människor, till exempel för att studera zoonotiska sjukdomar. Här ger vi en fördjupad beskrivning av ett förfarande som används för att odla gristarm 3D-organoider från frysta epitelkrypter. Protokollet beskriver hur man kryokonserverar epitelkrypter från gristarmen och de efterföljande procedurerna för att odla 3D-tarmorganoider. De främsta fördelarna med denna metod är (i) den tidsmässiga dissociationen av isoleringen av krypter från kulturen av 3D-organoider, (ii) beredningen av stora lager av kryokonserverade krypter härrörande från flera tarmsegment och från flera djur samtidigt, och därmed (iii) minskningen av behovet av att ta prov på färsk vävnad från levande djur. Vi beskriver också ett protokoll för att etablera cellmonolager härledda från 3D-organoider för att möjliggöra åtkomst till den apikala sidan av epitelceller, vilket är platsen för interaktioner med näringsämnen, mikrober eller läkemedel. Sammantaget är de protokoll som beskrivs här en användbar resurs för att studera gristarmepitelet i veterinärmedicinsk och biomedicinsk forskning.
Tarmepitelet bildas av ett monolager av celler som täcker matsmältningsslimhinnan vid gränssnittet med den luminala miljön. Denna position är förknippad med olika funktioner, såsom näringsabsorption och barriärfunktion, som stöds av närvaron av stamceller och flera differentierade epitelcelltyper (absorptiva, enteroendokrina, Paeth- och bägarceller)1. Odödliga cellinjer som traditionellt används för att studera epitelceller har stora begränsningar, eftersom de inte återspeglar tarmepitelets cellulära komplexitet och uppvisar genomiska abnormiteter2. Utvecklingen av tredimensionella (3D) organoider av Sato et al.3 gav en ny modell för att studera tarmepitelet med förbättrad fysiologisk relevans. Faktum är att intestinala organoider härrör från icke-transformerade stamceller, består av flera celltyper och rekapitulerar funktionaliteten hos tarmepitelet. Intestinala organoider används alltmer för att förstå utvecklingen och funktionerna i tarmepitelet och dess interaktioner med patogener, näringsämnen, toxiner, läkemedel, mikrobioten och dess metaboliter2.
Ursprungligen utvecklades för människor och möss, de metoder som används för att odla tarmorganoider har nyligen anpassats till andra arter, inklusive grisar4. Gonzales et al.5 var de första som odlade grisorganoider från jejunum; Sedan dess har svinorganoider beskrivits för andra tarmsegment (tolvfingertarmen, ileum och kolon)6,7,8, och har visat sig behålla en platsspecifik fenotyp 9,10,11. Gristarm 3D-organoider används nu ofta för att studera effekten av näringsämnen 12,13 eller enteriska infektioner 6,8,14.
De flesta av studierna har beskrivit kulturen av intestinala organoider som börjar från nyligen isolerade epitelkryptor. Detta är dock inte alltid möjligt av logistiska skäl, särskilt när man arbetar med stora djur som grisar. Faktum är att djuranläggningar för grisar kan placeras långt ifrån laboratoriet där organoider odlas, vilket komplicerar arbetsorganisationen. Dessutom är organoidkulturen tidskrävande; Således är det inte praktiskt att samtidigt odla flera organoidlinjer, till exempel från olika tarmsegment eller flera djur. För att kringgå dessa problem har några studier på människor, hästar och grisar beskrivit metoder för att odla organoider från frysta tarmvävnader (eller biopsier) eller från isolerade epitelkrypter 4,15,16,17. Dessa metoder möjliggör kryokonservering av tarmepitelstamceller från flera tarmsegment av ett enda djur, som sedan kan användas för att odla organoider vid behov. Dessutom möjliggör detta en kraftig minskning av antalet levande djur som används som donatorer av stamceller, eftersom stora lager av kryokonserverade krypter kan skapas (principerna för 3R). En annan fördel med denna metod är tillväxten av intestinala organoider endast från djur av intresse efter att ha erhållit fenotypiska eller genotypiska resultat, vilket är mycket kostnadseffektivt.
In vivo polariseras intestinala epitelceller, med den apikala sidan riktad mot lumen. In vitro, i 3D-organoider, är den apikala sidan av epitelceller också vänd mot lumen (dvs inuti organoiderna)4. Denna organisation förhindrar åtkomst till den apikala sidan, vilket är ett problem när man studerar effekterna av luminala komponenter (t.ex. näringsämnen, mikrober, metaboliter) på epitelceller. För att kringgå denna nackdel har flera metoder utvecklats, såsom odling av organoidceller som 2D-monolager, mikroinjektion och polaritetsomvandling (“apikala organoider”)18,19. Kulturen av organoidcellmonolager framträder som det mest effektiva och lätthanterliga systemet. Principen är att dissociera 3D-organoider i enskilda celler och frö dem på ett cellodlingskärl som tidigare belagts med ett tunt lager av extracellulär matris (ECM)20. Under dessa odlingsbetingelser är den apikala sidan av epitelcellerna vänd uppåt och är därmed tillgänglig för experimentella behandlingar20. Kulturen av organoidcellmonolager anpassades nyligen för gristarmen21,22; cellmonolager härrörande från gris 3D-organoider har använts för flera applikationer, inklusive studier av enteriska infektioner 6,23,24,25, transport av näringsämnen9 och modellering av matsmältningssjukdomar 26.
Här presenterar denna studie först ett detaljerat protokoll för odling och underhåll av gristarm 3D-organoider härrörande från kryokonserverade epitelkrypter (figur 1). Därefter beskrivs ett protokoll för att etablera cellmonolager från gristarmens 3D-organoider. Metoderna som beskrivs här ger experimentella verktyg som kan användas för att studera gristarmepitelet för näringstransport, barriärfunktion och värd-mikroorganisminteraktioner.
Detta protokoll beskriver en metod som används för att kryokonservera epitelkrypter från gristarmen för långvarig lagring och efterföljande odling av 3D-organoider. Detta protokoll använder en fryslösning innehållande DMSO, FBS, Y27632 ROCK-hämmaren, DMEM och antibiotika. En annan studie på grisar erhöll organoider från krypter kryokonserverade i en liknande fryslösning men utan ROCK-hämmaren15. Y27632 ROCK-hämmaren inkluderades för att förhindra apoptos och upprätthålla stamcellspoolen eftersom epiteliala kryptceller dissocieras efter upptining, vilket kan leda till celldöd (“anoikis”)27,28. Intressant nog har hästenteroider erhållits från epitelkrypter frysta i ett odlingsmedium innehållande endast DMEM och DMSO16; Denna enkla metod har inte testats för grisepitelkrypter ännu. Andra metoder har publicerats för att odla humana och grisorganoider från frysta vävnader eller biopsier istället för epitelkrypter 4,17. Fördelen med denna metod är förmågan att direkt kryokonservera tarmvävnaderna utan att utföra kryptisoleringsproceduren, vilket kräver tid och laboratorieutrustning. Detta kan vara praktiskt när vävnaderna måste samlas långt från labbet. Vid isolering av krypterna omedelbart efter slakt kan emellertid stora delar av tarmen bearbetas för att erhålla ett mycket stort antal krypter, vilket inte är fallet när man utgår från små frysta vävnadsfragment. Efter upptining av epitelkrypter observerades organoider från 3-4 dagar efter sådd och delades efter 10 dagar. Detta är en långsammare tillväxthastighet än vid start av kulturen från färska epitelkrypter, för vilka organoiderna erhölls från dag 1 efter sådd, och kan vanligtvis delas runt dag 511. Khalil et al. rapporterade också en fördröjd tillväxt av grisenteroider vid start från frysta krypter15, vilket tyder på att stamceller kan kräva tid för att återställa sin proliferativa kapacitet. Vi fick också ett lägre antal organoider när vi startade från frysta krypter jämfört med färska krypter, vilket kan bero på att stamceller dör under frysningsprocessen. I vissa försök att tina krypter (<20%) fick vi inte organoider från frysta krypter, troligen på grund av en suboptimal kryokonserveringsprocedur (t.ex. fördröjd frysning efter kryptisolering på förmodligen mer än 1 h). Därför rekommenderar vi att du håller krypterna på is tills du räknar och fryser dem så snabbt som möjligt.
För 3D-organoider valde vi att använda ett kommersiellt organoidodlingsmedium formulerat för människor. Faktum är att tidigare rapporter har visat att grisintestinala organoider växer effektivt med detta medium 8,11,14,19,25,26,29,30. Det är av intresse för detta odlingsmedium att vara färdigt att använda och ha en standardiserad koncentration av tillväxtfaktorer inom en sats. Detta odlingsmedium är emellertid dyrt, dess sammansättning är inte avslöjad och det är därför inte möjligt att modulera dess sammansättning. Däremot har andra studier odlat gristarmorganoider i skräddarsydda medier innehållande farmakologiska hämmare, rekombinant tillväxtfaktor och / eller konditionerade medier 5,6,7,21. Även om den är mycket flexibel och billigare, är denna metod tidskrävande för produktion av konditionerade medier och kan sakna reproducerbarhet på grund av potentiell variation i koncentrationen av tillväxtfaktorer i konditionerade medier. Således bör kvaliteten på varje sats av konditionerade medier valideras genom mätning av organoidtillväxt eller markörgenuttryck31.
En studie har visat att gris jejunala organoider odlade i samma kommersiella organoidodlingsmedium som används här växte snabbare och verkade mindre differentierade jämfört med enteroider odlade med media innehållande rekombinant tillväxtfaktor och / eller konditionerade medier23. Ett högt proliferativt tillstånd underlättar odlingen av 3D-organoider, men kan kräva inducerande differentiering för att vara mer representativ för tarmfysiologiska egenskaper. I detta protokoll, för passage av 3D-organoider, dissocieras cellerna fullständigt för räkning, vilket gör det möjligt att kontrollera antalet celler som ympas i ECM. Detta ökar reproducerbarheten av fenotypen av organoider, vilket påverkas starkt av deras densitet. Dessutom undviker man genom att räkna cellerna att få för låg eller en överfull kultur, vilket kräver anpassning av odlingsschemat. De flesta andra studier förberedde organoidfragment som inte var helt dissocierade till enskilda celler och använde ett utspädningsförhållande för passaging. Denna metod är enklare, men kan inducera variation beroende på kulturens organoiddensitet.
För odlingen i monolager sås organoidceller i odlingsinsatser förbelagda med ett tunt lager ECM, som möjliggör bindning av celler men undviker tillväxt av organoider i 3D. Detta protokoll använde kollagen typ IV som ett ECM-protein, som beskrivits tidigare hos grisar23. Andra studier med grisorganoidmonolager använde samma tumörhärledda ECM som används här för att odla 3D-organoider 6,8,9,21,25,30. Fördelen med att använda kollagen är förmågan att standardisera proteinkoncentrationen med en fullständigt definierad komposition, vilket inte är fallet i tumör-härledd ECM. Ett kritiskt steg för framgången med kulturen av cellmonolager är att uppmärksamma det visuella utseendet hos föregångaren 3D-organoider, som ska ha väldefinierade kanter och en tom lumen utan svarta skräp. Faktum är att organoider med hög mognadsnivå och låg proliferativ hastighet inte är en lämplig källa till celler för 2D-odling. Således är tidpunkten för dissociationen av 3D-organoider i enskilda celler avgörande för framgången med detta steg.
Kulturen av 2D-monolager från enskilda celler möjliggör standardisering av antalet celler som utsädes, vilket är svårare när man börjar från organoidfragment, som utförs i vissa andra metoder. Vi sådde 7,6 x 10 5 celler per cm 2, vilket är högt jämfört med de flesta andra studier 21,22,23 hos grisar som använde en lägre celldensitet, allt från0,25 x 10 5 celler per cm 2 till 1,78 x 10 5 celler per cm2. Kravet på ett stort antal organoidceller utgör en begränsning av detta protokoll, men det gjorde det möjligt för oss att snabbt få ett konfluent monolager som helt täcker odlingsinsatsen efter 1 dag. Däremot erhöll Vermeire et al.23 sammanflöde efter 4-7 dagar med en lägre densitet av celler sådda (från 0,25 x 10 5 celler / cm 2 till 0,4 x 105 celler / cm2). Vissa studier har också använt monolager av organoidceller från gris som inte helt täckte odlingsytan för infektioner med virus 8,30. Under dessa förhållanden är den apikala sidan av epitelceller tillgänglig för behandlingar, men helt sammanflytande monolager krävs om målet är att studera näringsabsorption eller epitelpermeabilitet.
För organoidcellmonolager användes ett kommersiellt organoidodlingsmedium kompletterat med 20% FBS, baserat på en nyligen genomförd studie på bovina enteroid-härledda monolager32. I våra tester var tillskottet med 20% FBS nödvändigt för att erhålla helt sammanflytande monolager, troligen på grund av ett högt tillväxtfaktorkrav. Tvärtom har andra studier som använder samma kommersiella medium etablerat monolager utan ytterligare FBS 8,25,30, men utan att nå full sammanflöde. Andra studier har också använt tillskott med 20% FBS i ett anpassat medium för odling av grisorganoidcellmonolager21,22. I våra experiment är TEER hög 1 dag efter sådd (cirka 700 Ω cm 2) och förblir hög fram till dag 3 (cirka 1 500 Ω cm2; detta överensstämmer med bildandet av snäva korsningar, vilket indikeras av uttrycket av ockludin. Van der Hee et al. erhöll liknande TEER-värden över 72 timmar för jejunumorganoidcellmonolager21. De visade också att monolager kan bibehållas fram till dag 12-15 med dagliga medieförändringar. Däremot har andra studier rapporterat mycket lägre TEER-värden (cirka 200 Ω·cm2) för grisorganoidcellmonolager 6,22. Dessa skillnader mellan studier kan vara relaterade till det studerade tarmsegmentet eller till de medier som används som påverkar epiteldifferentiering.
Sammanfattningsvis underlättar ovanstående protokoll för att odla gristarm 3D-organoider från frysta epitelkrypter organisationen av kulturarbetet. Det minskar behovet av färska vävnader som ska erhållas från levande djur. Vi förklarar också hur man etablerar helt sammanflytande cellmonolager härledda från grisorganoider på mindre än 3 dagar. Således kan våra protokoll vara användbara resurser för forskare som studerar gristarmepitelet för veterinärmedicinsk eller biomedicinsk forskning.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Institut Carnot France Futur Elevage (“OrganoPig” -projektet) och av INRAE HOLOFLUX (“Holopig” -projektet). Författarna är tacksamma för Genotoul core facilities (TRI). Vi tackar Christelle Knudsen (GenPhySE, INRAE, Toulouse) för noggrann korrekturläsning.
0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | Store at room temperature. |
15 mL conical tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
24-well cell culture plate | Corning | 003526 | |
48-well cell culture plate | Corning | 003548 | |
50 mL polypropylene conical tube | Falcon | 352070 | |
Bovine Serum Albumine (BSA) | Euromedex | A6003 | Store at 4 °C. |
Centrifuge Universal 320 R | Hettich | 1406 | |
Collagene type IV from human placenta | Sigma | C5533 | Prepare the stock solution at 1 mg/mL in acetic acid according to the manufacturer's recommendation. Aliquot (500 µL) and store at -20 °C. |
CoolCell LX Cell Freezing Container | Corning | 432003 | Used to cryopreserve crypts and organoids. |
Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | 16842556 | |
Coverslips, 22 mm x 50 mm | VWR | 630-1845 | |
Cryotube ClearLine 1 mL | Clear line | 390706 | Used to cryopreserve crypts and organoids. |
DAPI | Invitrogen | D1306 | Prepare the stock solution at 5 mg/mL in water according to the manufacturer’s recommendation. Aliquot (20 µL) and store at -20 °C |
Dithiothreitol (DTT) | Merck | 10197777001 | Store at 4 °C. |
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 31966047 | Store at 4 °C. |
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Corning | 25-950-CQC | Store at room temperature. |
Epredia Superfrost Plus Adhesion microscopic slide | VWR | 631-9483 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | Store 5 mL aliquots at -20 °C. |
Fisherbrand Sterile Cell Strainers | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | Used for crypt isolation. |
Fixed Tilt 3D Platform Rotator | VWR | 97025-564 | Used for incubations in the immunostaining protocol. |
Gibco PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010015 | Store at 4 °C. |
Gibco TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12605-010 | Enzyme dissociation reagent. Store at room temperature. |
Goat anti-rabbit IgG, Alexa fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | Secondary antibody. Store at 4 °C. Working dilution 1:1000. |
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | Stem Cell Technology | 6010 | Organoid culture medium. Store at -20 °C. Thaw the basal medium and organoid supplement at room temperature and mix (1:1). Store the mix at 4 °C for up to 1 week. |
Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells | Corning | 353095 | |
Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS2 | |
Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | Tumor-derived extracellular matrix used for the 3D culture of organoids. Matrigel polymerizes at room temperature. Use cooled tips to pipet the Matrigel. Prepare 500 µL aliquots and store at -20 °C. |
Mounting medium for fluorescence with DAPI | Vectashield | H1250 | Store at 4 °C. |
Occludin polyclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | 71-1500 | Primary antibody. Store at -20 °C. Working dilution 1:200. |
Paraformaldehyde 32% | Electron microscopy science | 15714 | Prepare 4% paraformaldehyde (PFA) solution under chemical hood by adding 5 mL of 32% PFA to 35 mL of PBS. Aliquot by 10 mL and store at -20 °C. |
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | Antibacterial. Store 5 mL aliquots at -20 °C. |
Phalloidin TRITC | Sigma | P1951 | Probe for actin staining. 1 mg/mL stock solution. Store at 4 °C. |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-05 | Antimicrobial agent for primary cells acting on bacteria, mycoplasma and fungi. Store at -20 °C. |
ROCK Inhibitor (Y27632) | ATCC | ACS-3030 | Used to maintain the stem cells. Prepare the stock solution at 10 mM in sterile water according to the manufacturer's recommendation and store aliquots (50 µL) at -20 °C. |
Rotating shaker mix XL | Clear line | 062646CL | Used for crypt isolation. |
Stripette Serological Pipets 10 mL | Corning | 4488 | |
Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
Triton X100 | Sigma | 8787 | Store at room temperature. |
Trypan Blue stain 0.4% | Thermo Fisher Scientific | T10282 | Store at room temperature. |
Vacuum system Vacusip | Integra | 159000 | Used to remove the medium of organoid wells. |