这里介绍的是一种基于流式细胞术的技术,可以同时测量细胞分裂次数、表面细胞表型和细胞亲缘关系。可以使用基于排列的框架对这些属性进行统计测试。
很少有技术可以同时评估同一细胞的表型和命运。目前用于表征表型的大多数协议虽然能够生成大型数据集,但需要破坏感兴趣的细胞,从而无法评估其功能命运。因此,很难描述造血等异质性生物分化系统。在细胞分裂追踪染料的基础上,我们进一步开发了一种方案,以同时确定许多单个造血祖细胞的亲属关系、分裂数和分化状态。该协议允许评估从各种生物来源分离的小鼠和人类造血祖细胞的 离体 分化潜力。此外,由于它基于流式细胞术和有限数量的试剂,因此它可以以相对便宜的方式在单细胞水平上快速生成大量数据。我们还提供用于单细胞分析的分析管道,并结合强大的统计框架。由于该协议允许在单细胞水平上连接细胞分裂和分化,因此可用于定量评估对称和不对称命运承诺,自我更新和分化之间的平衡以及给定承诺命运的分裂次数。总之,该协议可用于实验设计,旨在从单细胞角度揭示造血祖细胞之间的生物学差异。
过去十年的特点是细胞和分子生物学的单细胞方法在全球范围内传播。继单细胞基因组学1,2的步骤之后,如今可以研究单个细胞的许多成分(例如,DNA,RNA,蛋白质),并且每年都有新的单细胞组学技术涌现。这些技术揭示了免疫学、神经生物学、肿瘤学等领域的新旧问题,包括使用人类和模型生物细胞3。通过强调单个细胞之间的差异,单细胞组学促使定义了一种新的造血模型,该模型以造血干细胞和祖细胞(HSPC)的异质性为中心,并摆脱了离散同质群体的经典模型4,5。
所有组学技术的少数缺点之一是目标细胞的破坏,排除了评估其功能的可能性。相反,其他单细胞方法,如单细胞移植测定和谱系示踪技术,通过评估体内单个细胞的命运来读取祖先细胞的功能6,7。谱系追踪技术涉及用可遗传的遗传7或荧光标记8,9标记感兴趣的细胞,从而可以同时跟踪多个单细胞的命运。然而,起始细胞的表征通常仅限于有限数量的参数,例如通过流式细胞术10评估的几种表面蛋白的表达。此外,单细胞谱系示踪技术需要费力地检测细胞标记,通常通过DNA/RNA测序或成像。最后一点尤其限制了可以在单个实验中测试的条件数量。
另一类用于研究单细胞功能的方法是单HSPC的离体细胞培养系统。 这些金标准测定易于执行,涉及将单个细胞分选到 96 孔细胞培养容器中,并在培养后表征细胞后代表型,通常通过流式细胞术或形态学分析。这些测定主要用于表征HSPC长期分化为成熟细胞,通常在培养2-3周后11,12。或者,它们已被用于尝试维持和扩增离体HSPCs13,14,15,16,17,18,有望为人类干细胞移植带来医疗益处19。最后,它们已被用于使用短期培养20研究HSPC的早期承诺,其中该培养物中产生的细胞数量少是主要的限制因素。这些不同类型的离体测定的一个缺点是它们只能部分反映体内复杂性;尽管如此,它们仍然是研究人类HSPC分化的罕见方法之一。
现有单细胞方法(单细胞组学、谱系追踪和 离体 培养)中缺少的一个信息是准确检测细胞分裂,这是研究HSPC动力学21时要考虑的基本参数。通过流式细胞术 评估 分裂次数的一种简单方法是使用可溶性“蛋白质染料”,如5-(和6)-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)22。这些分裂染料扩散在染色细胞的细胞质内,并稀释一半并在每次细胞分裂时传递给两个子细胞,允许计数多达10次分裂。结合几种分裂染料,可以在同一孔中播种多个单独的祖细胞,因为每种单独的染料都允许分离不同的后代。这就是使用细胞染料进行多重克隆和分裂跟踪的原理,该染料最初引入鼠淋巴细胞23,24。
在这里,我们介绍了用于小鼠和人类HSPC的MultiGen测定的开发。它允许同时测试许多单细胞的分化、分裂和 离体亲缘关系的特性。这种高通量、易于执行且价格低廉的测定方法允许同时测量细胞表型、进行的分裂次数以及与孔中其他细胞的细胞亲缘关系和克隆关系。它可以用来定量评估对称和不对称的命运承诺,自我更新和分化之间的平衡,以及给定承诺命运所需的划分数量。该方案需要荧光活化细胞分选仪(FACS)和带酶标仪的流式细胞仪,以及进行细胞培养所需的设备。除了执行人HSPC测定的技术协议外,我们还提供详细的分析框架,包括评估与细胞家族25概念相关的细胞特性所需的统计测试。该协议已成功用于描述小鼠HSPC隔室26,27。
以下方案使用富含磁性的CD34 + 细胞作为起始材料28。通过这种方式,可以有效地染色和分离来自不同血液来源(例如,脐带血、骨髓、外周血)的人HSPC。重要的是不要丢弃CD34– 级分,因为它将用作设置不同类型的实验对照的协议的一部分。上述细胞数量和体积可以根据实验工作流程和必要性放大或缩小。同样,该方案可以适用于不同类型的祖细胞的研究,只需修改用于细胞分选和流式细胞术步骤的抗体即可。
MultiGen 检测是一种高通量、易于执行且价格低廉的检测方法,有助于研究淋巴细胞 23、24、35 和鼠造血细胞26,27。在这里,我们介绍了该方法的新发展,该方法允许使用短期培养在单细胞水平上破译人类HSPC承诺的早期阶段(图6)。单细胞离体培养系统通常用于评估HSPC进入成熟细胞的长期命运,但有些命运比其他命运发生得更早36,这可能使分析偏向于更少的命运。此外,这些文化系统通常会在命运承诺期间错过有关分裂的信息。第一个承诺步骤早在文化开始时就已经发生,有时没有划分26,37,这使得短期文化和跟踪分裂对于研究早期命运承诺至关重要。通过同时跟踪命运,分裂和亲属关系,该测定可以了解第一次分裂和命运决定在人类HSPC中的作用。 使用该测定法,可以推断承诺过程发生多少次分裂,这些早期祖先的自我更新和分化之间的平衡,以及这些属性如何代代相传。据我们所知,这是唯一允许以单细胞分辨率对人类HSPC进行这些类型测量的测定。此外,使用不同的细胞分裂染料组合,我们提高了分析的通量,使该测定成为快速生成大型数据集的宝贵工具。染料组合允许跟踪同一孔中的多个家族,从而增加了可用于短期培养分析的细胞数量。通过添加其他染料(例如,黄色染料)或修改CFSE和CTV的比例,组合的数量可能会进一步增加。但是,这减少了可以分析的其他参数的数量。
图 6:协议的示意图。 请单击此处查看此图的大图。
为了成功进行分析,由于孔数量多且要分析的细胞数量减少,有必要在配备酶标仪的分析仪上运行流式细胞术分析。新一代台式分析仪特别适用于这种测定,因为它们中的大多数具有较小的死体积,以减少细胞损失的百分比。这反过来又保证了回收整口井的更高效率,促使效率估计在70%范围内26。估计流式细胞术采集过程中的细胞损失对于每个家族的分析至关重要。例如,假设没有细胞死亡并计算分裂次数,则可以估计每个家庭的细胞数量。然而,希望进行一些验证性实验,特别是在测试的培养条件下估计细胞死亡和使用定义数量的细胞进行实验测量回收率。
该协议的关键步骤之一是峰值分配。如前所述,高质量的峰分布在很大程度上取决于细胞分选时非常窄的峰的分离。然而,仍然很难根据分布情况分配正确数量的分区。由于细胞分选和流式细胞术分析是在两台不同的机器上进行的,因此无法直接比较每个信号的强度,因此可能很难知道在直方图右端观察到的第一个峰是峰0还是峰1。在这方面,几乎没有什么解决办法是可能的。一种方法是进行正交实验以准确测量这些细胞进行的分裂次数(例如,活细胞成像)。另一种可能性是在运行流式细胞术分析之前,简单地在倒置明场显微镜下计数孔中的细胞数量。这将推断出平均分裂次数(假设没有细胞死亡)。最后,峰值分配的事后解决方案是检测异常数量的“不可能的家族”;这些家族由每代可能数量的细胞组成(例如,第 2 代的五个细胞,或第 1 代的两个细胞和第 2 代的一个细胞)。排除不可能族的可能性在统计分析步骤中编码,并标记不可能族。如果这些误差的发生率太高,则可以合理地假设需要修改峰值分配。
在该协议中,我们包括了一些用于测定的数据表示和分析示例,因为这已成为生成和解释大型数据集的重要步骤38。第一个例子是热图,显示所有分析细胞的总数,按家庭组织。这是探索数据的一般属性和潜在结论的有效工具:家族是由多种细胞类型组成的,还是它们在组成上趋于同质?家庭是分散在多代人中,还是他们大多分裂的次数相同?然后,这种探索性分析需要辅以更具体的绘图和统计测试。它可以用来定量评估对称和不对称的命运承诺、无分裂的分化、自我更新和分化之间的平衡,以及给定承诺命运的分裂次数。在实验计划期间,根据所问问题的类型设置细胞培养长度至关重要;例如,对于前两个问题(对称/不对称平衡和无分裂的分化),规划非常短的培养步骤可以隔离大量仅进行一次或根本没有进行分裂的家族26。相反,更长的实验允许探索特定细胞承诺所需的分裂次数,因为它们对处于不同分化阶段的家族进行采样。然而,该方法不是为长期培养(2-3周)而设计的,因为细胞染料稀释不能准确地跟踪超过7或8个分裂22。因此,该工具主要适用于研究造血祖细胞的早期承诺,而不是对这些细胞的长期分化特性做出可靠的结论。
统计框架是专门为分析这类数据而制定的,并基于排列的概念26。这是必要的,因为观察到家族对细胞类型分布和所进行的分裂次数的依赖性。换句话说,属于同一家族的细胞也更有可能表现出相似的表型并分裂相同的次数。虽然深入分析超出了这项工作的范围,但在评估不同条件时,提供的一组统计测试应该足够了。
总之,该协议构成了以快速和廉价的方式评估造血干和祖细胞离 体细胞的细胞动力学的宝贵工具。由于其在时间点、培养条件和分析的 HSPC 类型方面的灵活性和多功能性,它允许测试各种实验条件。作为一种基于流式细胞术的测定,它可以在大多数实验室中实施,并且不需要广泛的先验知识,使其成为筛选和试点实验的良好候选者。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢居里研究所流动设施的成员在建立流式细胞术实验方面的帮助。我们还要感谢佩里团队其他成员在多次讨论中的贡献。我们感谢Julia Marchingo博士和Phil Hodgkin教授(Walter end Eliza Hall医学研究所)分享他们在淋巴细胞上多路复用细胞分裂染料的方案。我们感谢圣路易斯医院脐带血生物库为制定该协议提供必要的生物资源。该研究得到了CNRS和Bettencourt-Schueller基金会(L.P.)的ATIP-Avenir资助, Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038)(L.P.和A.D.),Idex Paris-Science-Lettres计划(ANR-10-IDEX-0001-02 PSL)(L.P.),Canceropole INCA出现(2021-1-EMERG-54b-ICR-1,L.P.)和ITMO MIIC资助(21CM044,L.P.)的资助。除了欧洲研究理事会(ERC)在欧盟地平线2020研究和创新计划ERC StG 758170-Microbar(至LP)下的资金外,AD还得到了法国基金会的奖学金支持。
1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes | vWR | 87003-294 | |
15-mL polypropylene tubes | vWR | 734-0451 | |
50-mL polypropylene tubes | vWR | 734-0448 | |
96-well U-bottom culture plate | Falcon | 353077 | |
Anti-human Lin APC | Thermo Fisher | 22-7776-72 | Dilution 1/40 |
ARIA III | BD | Can be replaced with any FACS sorter able to sort individual cells in 96-wells plate | |
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Life Technologies | C34570 | |
Cell Trace Violet (CTV) | Life Technologies | C34571 | |
Compensation beads | BD | 552843 | |
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Life Technologies | 11320033 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Thermo Scientific | J62948-36 | Prepare a solution 0.5 M, in sterilised water |
FC block Fc1.3216 | BD | 564220 | Dilution 1/50 |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Dutscher | S1900-500C | Batch S00CH |
FlowJo v10.8.1 | BD | ||
Mouse anti-human CD10 PerCP-5.5, clone HI10a | Biolegend | 312216 | Dilution 1/20 |
Mouse anti-human CD123 BUV395, clone 7G3 | BD | 564195 | Dilution 1/15 |
Mouse anti-human CD34 APC-Cy7, clone 581 | Biolegend | 343513 | Dilution 1/40 |
Mouse anti-human CD38 BV650, clone HB7 | Biolegend | 356620 | Dilution 1/40 |
Mouse anti-human CD45RA AF700, clone HI100 | BD | 560673 | Dilution 1/20 |
Mouse anti-human CD45RA PE-Cy7, clone HI100 | BD | 560675 | Dilution 1/20 |
Mouse anti-human CD90 PE, clone 5E10 | Biolegend | 328110 | Dilution 1/20 |
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X | Life Technologies | 10010001 | |
Python | |||
R | |||
Sterile 12×75 mm conical polypropylene tubes | Falcon | ||
ZE5 | Biorad | Can be replaced with any flow cytometry analyzer equipped with a plate reader | |
Laboratory prepared | |||
Cell culture media | Depends from the specific experiment. Prepare fresh daily and store at +4 °C until use | ||
DMEM + 10% FBS | Can be stored in sterile conditions, at +4 °C up to 1 year. To prepare 500 mL, add 50 mL of FBS to 450 mL DMEM | ||
PBS 1X + EDTA 0.1% | Can be stored in sterile conditions, at room temperature, up to 1 year. To prepare 500 mL, add 3.42 mL of EDTA 0.5 M to 500 mL PBS 1X | ||
Staining buffer | Can be stored in sterile conditions, at +4 °C up to 1 year. To prepare 500 mL, add 2 mL of EDTA 0.5 M and 1 mL FBS to 500 mL PBS 1X |