JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
생물학

Generering og vedligeholdelse af primatinducerede pluripotente stamceller afledt af urin

Published: July 28, 2023
doi:
10.3791/64922
, , , ,
1Faculty of Biology,Ludwig Maximilian University of Munich, 2Institute for the Advanced Study of Human Biology,Kyoto University, 3Hakubi Center,Kyoto University

Summary

Denne protokol beskriver en metode til at isolere, udvide og omprogrammere humane og ikke-humane primaturinafledte celler til inducerede pluripotente stamceller (iPSC’er) samt instruktioner til feederfri vedligeholdelse af de nyligt genererede iPSC’er.

Abstract

Tilgange på tværs af arter, der studerer primatpluripotente stamceller og deres derivater, er afgørende for bedre at forstå de molekylære og cellulære mekanismer for sygdom, udvikling og evolution. For at gøre primatinducerede pluripotente stamceller (iPSC’er) mere tilgængelige præsenterer dette papir en ikke-invasiv metode til at generere humane og ikke-menneskelige primat-iPSC’er fra urinafledte celler og deres vedligeholdelse ved hjælp af en feederfri dyrkningsmetode.

Urinen kan udtages fra et ikke-sterilt miljø (f.eks. dyrets bur) og behandles med en bredspektret antibiotikacocktail under primær cellekultur for effektivt at reducere forureningen. Efter formering af de urinafledte celler genereres iPSC’er ved en modificeret transduktionsmetode af et kommercielt tilgængeligt Sendai-virusvektorsystem. Første iPSC-kolonier kan allerede være synlige efter 5 dage og kan tidligst plukkes efter 10 dage. Rutinemæssig klumppasning med enzymfri dissociationsbuffer understøtter pluripotens af de genererede iPSC’er i mere end 50 passager.

Introduction

Genomiske sammenligninger af menneskelige og ikke-menneskelige primater (NHP’er) er afgørende for at forstå vores evolutionære historie og udviklingen af menneskespecifikke træk1. Derudover giver disse sammenligninger mulighed for slutning af funktion ved at identificere konserverede DNA-sekvenser2, f.eks. for at prioritere sygdomsassocierede varianter3. Sammenligninger af molekylære fænotyper såsom genekspressionsniveauer er afgørende for bedre at fortolke genomiske sammenligninger og for at opdage for eksempel cellulære fænotypiske forskelle. Desuden har de – i lighed med sammenligninger på DNA-niveau – potentialet til at udlede funktionel relevans og dermed bedre fortolke medicinsk relevant variation inden for mennesker4. Indarbejdelsen af omfattende molekylære fænotypiske data i disse komparative undersøgelser kræver passende biologiske ressourcer (dvs. ortologe celler på tværs af arter). Etiske og praktiske grunde gør det imidlertid vanskeligt eller umuligt at få adgang til sådanne sammenlignelige celler, især under udvikling. Inducerede pluripotente stamceller (iPSC’er) giver mulighed for generering af sådanne utilgængelige celletyper in vitro5,6, er eksperimentelt tilgængelige og er blevet anvendt til primatsammenligninger 6,7,8,9,10,11,12,13,14.

For at generere iPSC’er skal man erhverve de primære celler, der skal omprogrammeres. Celler, der er isoleret fra urinen, har den fordel, at de kan udtages ikke-invasivt fra primater, og at de let kan omprogrammeres, sandsynligvis på grund af deres stamcellelignende molekylære profiler15. Kulturbetingelserne for at opretholde primat-iPSC’er er lige så vigtige som omprogrammering; Klassisk krævede kulturen af humane pluripotente stamceller et ikke-defineret, serumbaseret medium og co-kultur af embryonale fibroblaster hos mus – såkaldte fødeceller – der leverer essentielle næringsstoffer og et stillads til embryonale stamceller (ESC’er)16. Siden udviklingen af kemisk definerede og føderfrie dyrkningssystemer17,18 er der nu forskellige muligheder for kommercielt tilgængelige iPSC-kulturmedier og matricer. Imidlertid er de fleste af disse kulturforhold optimeret til menneskelige ESC’er og iPSC’er og fungerer derfor muligvis mindre godt i NHP iPSC-kultur. I denne videoprotokol giver vi instruktioner til generering og vedligeholdelse af humane og NHP iPSC’er afledt af urincellekultur.

Siden den første rapport om iPSC-generering ved tvungen ekspression af definerede faktorer i fibroblaster i 2006 er denne metode blevet anvendt på mange forskellige celletyper af forskellig oprindelse 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. Blandt dem kan kun urinafledte celler opnås på en fuldstændig ikke-invasiv måde. Baseret på den tidligere beskrevne protokol af Zhou et al.33 kan man isolere og udvide celler fra primaturin, selv fra ikke-sterile prøver, ved at supplere bredspektret antibiotika15. Især urinafledte celler, der udtages prøver af denne protokol, udviser et stort potentiale for at producere iPSC’er inden for en kortere periode (kolonier bliver synlige på 5-15 dage) end den konventionelle omprogrammering af fibroblaster (20-30 dage, efter vores erfaring) og med en tilstrækkelig høj succesrate. Disse urinafledte celler blev klassificeret som den blandede population af mesenkymale stamcellelignende celler og blæreepitelceller, hvilket forårsagede den høje omprogrammeringseffektivitet15.

Ud over variationen i primære celler varierer omprogrammeringsmetoderne til generering af iPSC’er også alt efter anvendelsesformålet. Konventionelle omprogrammeringsprocedurer for humane somatiske celler blev udført ved overekspression af omprogrammeringsfaktorer med retrovirus- eller lentivirusvektorer, hvilket tillod integration af eksogent DNA i genomet 5,34,35. For at holde de genererede iPSC’er genomisk intakte har forskere udviklet en lang række ikke-integrationssystemer – excisable PiggyBac vector36,37, episomal vector38,39, ikke-integrerende virusvektorer såsom Sendai-virus40 og adenovirus 41, mRNA-transfektion 42, proteintransfektion 43,44 og kemisk forbindelsesbehandling 45. På grund af effektiviteten og letheden i håndteringen anvendes de Sendai-virusbaserede omprogrammeringsvektorer i denne protokol. Infektion af primære celler udføres i en 1 times suspensionskultur af celler og vira ved en mangfoldighed af infektion (MOI) på 5 før plettering. Dette modificerede trin kan øge sandsynligheden for kontakt mellem celleoverflader og vira sammenlignet med den konventionelle metode, hvor viraerne tilsættes direkte til den vedhængende cellekultur og dermed give flere iPSC-kolonier15.

Passaging af humane og NHP pluripotente stamceller kan ske ved klump passaging og single-cell passaging. Ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) er et omkostningseffektivt chelateringsmiddel, der binder calcium- og magnesiumioner og dermed forhindrer den klæbende aktivitet af cadherin og integrin. EDTA bruges også som et mildt, selektivt dissociationsreagens, da udifferentierede celler løsner sig før differentierede celler på grund af deres forskellige vedhæftningsmolekyler. Fuldstændig dissociation inducerer massiv celledød af primat-iPSC’er via den Rho/Rho-associerede spiral, der indeholder proteinkinase (Rho/Rock)-medieret myosinhyperaktivering. Derfor er det vigtigt at supplere dyrkningsmediet med en Rho/Rock-hæmmer til eksperimenter, der kræver enkeltceller i suspension46,47. I denne protokol anbefaler vi clump passaging som rutinemæssig passaging metode og anbefaler kun single-cell passaging, når det er nødvendigt, f.eks. når seeding af definerede cellenumre er påkrævet, eller under sub-kloning.

Protocol

Denne eksperimentelle procedure blev godkendt af det ansvarlige etiske udvalg for menneskelige eksperimenter (20-122, Ethikkommission LMU München). Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med relevante retningslinjer og regler.BEMÆRK: Der skal indhentes godkendelse fra det relevante etiske udvalg, inden forsøg med humane prøver og NHP-prøver påbegyndes. Alle eksperimentelle procedurer skal udføres i overensstemmelse med relevante retningslinjer og forskrifter. Hvert af følgende trin skal udføres ved hj?…

Representative Results

Ved isolering af celler fra human og NHP-urin kan forskellige typer celler identificeres direkte efter isolering. Planocellulære celler såvel som forskellige mindre runde celler udskilles med urinen; kvindelig urin indeholder langt flere pladeceller end mandlig urin (figur 1B – dag 0; Supplerende figur S1). Efter 5 dages dyrkning i primært urinmedium kan de første vedhængende prolifererende celler ses (figur 1A, B – dag 5)….

Discussion

iPSC’er er værdifulde celletyper, da de tillader generering af ellers utilgængelige celletyper in vitro. Da udgangsmaterialerne til omprogrammering, for eksempel, fibroblaster ikke er let tilgængelige fra alle primatarter, præsenterer dette papir en protokol til generering af iPSC’er fra urinafledte celler. Disse celler kan opnås på en ikke-invasiv måde, selv fra ikke-sterile primaturinprøver, ved at supplere dyrkningsmediet med bredspektret antibiotika.

Flere kritiske trin i …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af DFG EN 1093/5-1 (projektnummer 458247426). M.O. blev støttet af JSPS Overseas Research Fellowship. Alle figurer blev oprettet med BioRender.com. Flowcytometri blev udført ved hjælp af Core Facility Flow Cytometry på Biomedical Center Munich. Vi vil gerne takke Makoto Shida og Tomoyo Muto fra ASHBi, Kyoto University, for støtte til videografi.

Materials

Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution) Sigma-Aldrich SCR006
Amphotericin B-Solution Merck A2941-100ML
Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody  Stem Cell Technologies 60064 Dilution: 1/200
Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody  Miltenyi Biotec 130-122-965 Dilution: 1/50
Bambanker™ (Cell freezing medium) Nippon Genetics BB01
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3059-100G
Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR Greiner BIO-ONE 665180
Countess™ II automated cell counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes) Sued-Laborbedarf 52 95-0213 Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information.
CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) Thermo Fisher Scientific A16519
CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit) Thermo Fisher Scientific A16518
DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride Sigma-Aldrich 10236276001
DMEM High Glucose TH.Geyer L0102
DMEM/F12 w L-glutamine Fisher Scientific 15373541
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 Thermo Fisher Scientific A-21202 Dilution: 1/500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 Thermo Fisher Scientific A-21207 Dilution: 1/500
DPBS w/o Calcium w/o Magnesium TH.Geyer L0615-500
EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC) Thermo Fisher Scientific 710524 Dilution: 1/500
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Carl Roth CN06.3
Falcon Tube 15 mL conical bottom Greiner BIO-ONE 188271-N
Falcon Tube 50 mL conical bottom Greiner BIO-ONE 227261
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS) Thermo Fisher Scientific 10500064
FlowJo V10.8.2 FlowJo  663441
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich G1890-1KG
Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413301
GlutaMAX™ Supplement Thermo Fisher Scientific 35050038
Heracell™ 240i CO2 incubator Fisher Scientific 16416639
Heraeus HeraSafe safety cabinet Kendro 51017905
Human EGF, premium grade Miltenyi Biotec 130-097-749
ImageJ  Fiji Version 2.9.0
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Thermo Fisher Scientific 11140035
Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL Nerbe Plus 04-212-1000
Microscope Nikon eclipse TE2000-S Nikon TE2000-S
Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody R&D Systems MAB1368 Dilution: 1/100
Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody R&D Systems MAB1420 Dilution: 1/100
Mouse anti-beta-III Tubulin antibody R&D Systems MAB1195 Dilution: 1/100
mTeSR™ 1 STEMCELL Technolgies 85850
Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb  Cell Signaling Technology 4903S Dilution: 1/400
Normocure™ (Antimicrobial Reagent) Invivogen ant-noc
Oct-4 Rabbit Antibody  Cell Signaling Technology 2750S Dilution: 1/400
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 441244-1KG
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS) Thermo Fisher Scientific 15140122 Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin.
Recombinant Human FGF-basic PeproTech 100-18B
Recombinant Human PDGF-AB PeproTech 100-00AB
Refrigerated benchtop centrifuge SIGMA  4-16KS
Renal Epithelial Cell Basal Medium ATCC PCS-400-030
Renal Epithelial Cell Growth Kit ATCC PCS-400-040
Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900 Cell Signaling Technology 4900S Dilution: 1/400
SSEA4 (MC813) Mouse mAb NEB 4755S Dilution: 1/500
StemFit® Basic02 Nippon Genetics 3821.00 The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead.
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787-50ML
TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme) Thermo Fisher Scientific 12563011
Waterbath Precision GP 05 Thermo Fisher Scientific TSGP05
Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor) Biozol BYT-ORB153635
Antibody dilution buffer For composition see the supplementary table S1
Blocking buffer For composition see the supplementary table S1
REMC medium For composition see the supplementary table S1
Primary urine medium For composition see the supplementary table S1
PSC culture medium For composition see the supplementary table S1
PSC generation medium For composition see the supplementary table S1
Urine wash buffer For composition see the supplementary table S1
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pääbo, S. The human condition-a molecular approach. Cell. 157 (1), 216-226 (2014).
  2. Zoonomia Consortium, . A comparative genomics multitool for scientific discovery and conservation. Nature. 587 (7833), 240-245 (2020).
  3. Kircher, M., et al. A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants. Nature Genetics. 46 (3), 310-315 (2014).
  4. Enard, W. Functional primate genomics-leveraging the medical potential. Journal of Molecular Medicine. 90 (5), 471-480 (2012).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Wunderlich, S., et al. Primate iPS cells as tools for evolutionary analyses. Stem Cell Research. 12 (3), 622-629 (2014).
  7. Denli, A. M., et al. Primate-specific ORF0 contributes to retrotransposon-mediated diversity. Cell. 163 (3), 583-593 (2015).
  8. Ramsay, L., et al. Conserved expression of transposon-derived non-coding transcripts in primate stem cells. BMC Genomics. 18 (1), 214 (2017).
  9. Marchetto, M. C. N., et al. Differential L1 regulation in pluripotent stem cells of humans and apes. Nature. 503 (7477), 525-529 (2013).
  10. Gallego Romero, ., I, , et al. A panel of induced pluripotent stem cells from chimpanzees: a resource for comparative functional genomics. eLife. 4, 07103 (2015).
  11. Pavlovic, B. J., Blake, L. E., Roux, J., Chavarria, C., Gilad, Y. A comparative assessment of human and chimpanzee iPSC-derived cardiomyocytes with primary heart tissues. Scientific Reports. 8 (1), 15312 (2018).
  12. Rhodes, K., et al. Human embryoid bodies as a novel system for genomic studies of functionally diverse cell types. eLife. 11, 71361 (2022).
  13. Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  14. Dannemann, M., Gallego Romero, ., I, Harnessing pluripotent stem cells as models to decipher human evolution. The FEBS Journal. 289 (11), 2992-3010 (2022).
  15. Geuder, J., et al. A non-invasive method to generate induced pluripotent stem cells from primate urine. Scientific Reports. 11 (1), 3516 (2021).
  16. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  17. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
  18. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  19. Aoi, T., et al. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science. 321 (5889), 699-702 (2008).
  20. Kim, J. B., et al. Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors. Nature. 454 (7204), 646-650 (2008).
  21. Ruiz, S., et al. High-efficient generation of induced pluripotent stem cells from human astrocytes. PloS One. 5 (12), (2010).
  22. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  23. Park, I. -. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  24. Loh, Y. -. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
  25. Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Human Molecular Genetics. 18 (22), 4340-4349 (2009).
  26. Sun, N., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15720-15725 (2009).
  27. Giorgetti, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood using. OCT4 and SOX2. Cell Stem Cell. 5 (4), 353-357 (2009).
  28. Eminli, S., et al. Differentiation stage determines potential of hematopoietic cells for reprogramming into induced pluripotent stem cells. Nature Genetics. 41 (9), 968-976 (2009).
  29. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  30. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
  31. Zhou, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from urine. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1221-1228 (2011).
  32. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  33. Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nature Protocols. 7 (12), 2080-2089 (2012).
  34. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  35. Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448 (7151), 318-324 (2007).
  36. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  37. Kaji, K., et al. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature. 458 (7239), 771-775 (2009).
  38. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
  39. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  40. Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 11-14 (2010).
  41. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
  42. Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  43. Zhou, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 4 (5), 381-384 (2009).
  44. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
  45. Guan, J., et al. Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells. Nature. 605 (7909), 325-331 (2022).
  46. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  47. Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
  48. Ohnuki, M., et al. Dynamic regulation of human endogenous retroviruses mediates factor-induced reprogramming and differentiation potential. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (34), 12426-12431 (2014).
  49. Rouhani, F., et al. Genetic background drives transcriptional variation in human induced pluripotent stem cells. PLoS Genetics. 10 (6), 1004432 (2014).
  50. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  51. Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 28 (8), 848-855 (2010).
  52. Koyanagi-Aoi, M., et al. Differentiation-defective phenotypes revealed by large-scale analyses of human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (51), 20569-20574 (2013).
  53. Nishizawa, M., et al. Epigenetic variation between human induced pluripotent stem cell lines is an indicator of differentiation capacity. Cell Stem Cell. 19 (3), 341-354 (2016).
  54. Yokobayashi, S., et al. Inherent genomic properties underlie the epigenomic heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Cell Reports. 37 (5), 109909 (2021).

Tags

PrimateInduced Pluripotent Stem CellsUrinary CellsNon-invasiveSendai VirusReprogrammingBasement Membrane MatrixREMC MediumCentrifugationCell Culture
check_url/kr/64922?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Radmer, J., Geuder, J., Edenhofer, F. C., Enard, W., Ohnuki, M. Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine. J. Vis. Exp. (197), e64922, doi:10.3791/64922 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image