Denne protokol beskriver en metode til at isolere, udvide og omprogrammere humane og ikke-humane primaturinafledte celler til inducerede pluripotente stamceller (iPSC’er) samt instruktioner til feederfri vedligeholdelse af de nyligt genererede iPSC’er.
Tilgange på tværs af arter, der studerer primatpluripotente stamceller og deres derivater, er afgørende for bedre at forstå de molekylære og cellulære mekanismer for sygdom, udvikling og evolution. For at gøre primatinducerede pluripotente stamceller (iPSC’er) mere tilgængelige præsenterer dette papir en ikke-invasiv metode til at generere humane og ikke-menneskelige primat-iPSC’er fra urinafledte celler og deres vedligeholdelse ved hjælp af en feederfri dyrkningsmetode.
Urinen kan udtages fra et ikke-sterilt miljø (f.eks. dyrets bur) og behandles med en bredspektret antibiotikacocktail under primær cellekultur for effektivt at reducere forureningen. Efter formering af de urinafledte celler genereres iPSC’er ved en modificeret transduktionsmetode af et kommercielt tilgængeligt Sendai-virusvektorsystem. Første iPSC-kolonier kan allerede være synlige efter 5 dage og kan tidligst plukkes efter 10 dage. Rutinemæssig klumppasning med enzymfri dissociationsbuffer understøtter pluripotens af de genererede iPSC’er i mere end 50 passager.
Genomiske sammenligninger af menneskelige og ikke-menneskelige primater (NHP’er) er afgørende for at forstå vores evolutionære historie og udviklingen af menneskespecifikke træk1. Derudover giver disse sammenligninger mulighed for slutning af funktion ved at identificere konserverede DNA-sekvenser2, f.eks. for at prioritere sygdomsassocierede varianter3. Sammenligninger af molekylære fænotyper såsom genekspressionsniveauer er afgørende for bedre at fortolke genomiske sammenligninger og for at opdage for eksempel cellulære fænotypiske forskelle. Desuden har de – i lighed med sammenligninger på DNA-niveau – potentialet til at udlede funktionel relevans og dermed bedre fortolke medicinsk relevant variation inden for mennesker4. Indarbejdelsen af omfattende molekylære fænotypiske data i disse komparative undersøgelser kræver passende biologiske ressourcer (dvs. ortologe celler på tværs af arter). Etiske og praktiske grunde gør det imidlertid vanskeligt eller umuligt at få adgang til sådanne sammenlignelige celler, især under udvikling. Inducerede pluripotente stamceller (iPSC’er) giver mulighed for generering af sådanne utilgængelige celletyper in vitro5,6, er eksperimentelt tilgængelige og er blevet anvendt til primatsammenligninger 6,7,8,9,10,11,12,13,14.
For at generere iPSC’er skal man erhverve de primære celler, der skal omprogrammeres. Celler, der er isoleret fra urinen, har den fordel, at de kan udtages ikke-invasivt fra primater, og at de let kan omprogrammeres, sandsynligvis på grund af deres stamcellelignende molekylære profiler15. Kulturbetingelserne for at opretholde primat-iPSC’er er lige så vigtige som omprogrammering; Klassisk krævede kulturen af humane pluripotente stamceller et ikke-defineret, serumbaseret medium og co-kultur af embryonale fibroblaster hos mus – såkaldte fødeceller – der leverer essentielle næringsstoffer og et stillads til embryonale stamceller (ESC’er)16. Siden udviklingen af kemisk definerede og føderfrie dyrkningssystemer17,18 er der nu forskellige muligheder for kommercielt tilgængelige iPSC-kulturmedier og matricer. Imidlertid er de fleste af disse kulturforhold optimeret til menneskelige ESC’er og iPSC’er og fungerer derfor muligvis mindre godt i NHP iPSC-kultur. I denne videoprotokol giver vi instruktioner til generering og vedligeholdelse af humane og NHP iPSC’er afledt af urincellekultur.
Siden den første rapport om iPSC-generering ved tvungen ekspression af definerede faktorer i fibroblaster i 2006 er denne metode blevet anvendt på mange forskellige celletyper af forskellig oprindelse 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. Blandt dem kan kun urinafledte celler opnås på en fuldstændig ikke-invasiv måde. Baseret på den tidligere beskrevne protokol af Zhou et al.33 kan man isolere og udvide celler fra primaturin, selv fra ikke-sterile prøver, ved at supplere bredspektret antibiotika15. Især urinafledte celler, der udtages prøver af denne protokol, udviser et stort potentiale for at producere iPSC’er inden for en kortere periode (kolonier bliver synlige på 5-15 dage) end den konventionelle omprogrammering af fibroblaster (20-30 dage, efter vores erfaring) og med en tilstrækkelig høj succesrate. Disse urinafledte celler blev klassificeret som den blandede population af mesenkymale stamcellelignende celler og blæreepitelceller, hvilket forårsagede den høje omprogrammeringseffektivitet15.
Ud over variationen i primære celler varierer omprogrammeringsmetoderne til generering af iPSC’er også alt efter anvendelsesformålet. Konventionelle omprogrammeringsprocedurer for humane somatiske celler blev udført ved overekspression af omprogrammeringsfaktorer med retrovirus- eller lentivirusvektorer, hvilket tillod integration af eksogent DNA i genomet 5,34,35. For at holde de genererede iPSC’er genomisk intakte har forskere udviklet en lang række ikke-integrationssystemer – excisable PiggyBac vector36,37, episomal vector38,39, ikke-integrerende virusvektorer såsom Sendai-virus40 og adenovirus 41, mRNA-transfektion 42, proteintransfektion 43,44 og kemisk forbindelsesbehandling 45. På grund af effektiviteten og letheden i håndteringen anvendes de Sendai-virusbaserede omprogrammeringsvektorer i denne protokol. Infektion af primære celler udføres i en 1 times suspensionskultur af celler og vira ved en mangfoldighed af infektion (MOI) på 5 før plettering. Dette modificerede trin kan øge sandsynligheden for kontakt mellem celleoverflader og vira sammenlignet med den konventionelle metode, hvor viraerne tilsættes direkte til den vedhængende cellekultur og dermed give flere iPSC-kolonier15.
Passaging af humane og NHP pluripotente stamceller kan ske ved klump passaging og single-cell passaging. Ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) er et omkostningseffektivt chelateringsmiddel, der binder calcium- og magnesiumioner og dermed forhindrer den klæbende aktivitet af cadherin og integrin. EDTA bruges også som et mildt, selektivt dissociationsreagens, da udifferentierede celler løsner sig før differentierede celler på grund af deres forskellige vedhæftningsmolekyler. Fuldstændig dissociation inducerer massiv celledød af primat-iPSC’er via den Rho/Rho-associerede spiral, der indeholder proteinkinase (Rho/Rock)-medieret myosinhyperaktivering. Derfor er det vigtigt at supplere dyrkningsmediet med en Rho/Rock-hæmmer til eksperimenter, der kræver enkeltceller i suspension46,47. I denne protokol anbefaler vi clump passaging som rutinemæssig passaging metode og anbefaler kun single-cell passaging, når det er nødvendigt, f.eks. når seeding af definerede cellenumre er påkrævet, eller under sub-kloning.
iPSC’er er værdifulde celletyper, da de tillader generering af ellers utilgængelige celletyper in vitro. Da udgangsmaterialerne til omprogrammering, for eksempel, fibroblaster ikke er let tilgængelige fra alle primatarter, præsenterer dette papir en protokol til generering af iPSC’er fra urinafledte celler. Disse celler kan opnås på en ikke-invasiv måde, selv fra ikke-sterile primaturinprøver, ved at supplere dyrkningsmediet med bredspektret antibiotika.
Flere kritiske trin i …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af DFG EN 1093/5-1 (projektnummer 458247426). M.O. blev støttet af JSPS Overseas Research Fellowship. Alle figurer blev oprettet med BioRender.com. Flowcytometri blev udført ved hjælp af Core Facility Flow Cytometry på Biomedical Center Munich. Vi vil gerne takke Makoto Shida og Tomoyo Muto fra ASHBi, Kyoto University, for støtte til videografi.
Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution) | Sigma-Aldrich | SCR006 | |
Amphotericin B-Solution | Merck | A2941-100ML | |
Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody | Stem Cell Technologies | 60064 | Dilution: 1/200 |
Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody | Miltenyi Biotec | 130-122-965 | Dilution: 1/50 |
Bambanker™ (Cell freezing medium) | Nippon Genetics | BB01 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR | Greiner BIO-ONE | 665180 | |
Countess™ II automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes) | Sued-Laborbedarf | 52 95-0213 | Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information. |
CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) | Thermo Fisher Scientific | A16519 | |
CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit) | Thermo Fisher Scientific | A16518 | |
DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | 10236276001 | |
DMEM High Glucose | TH.Geyer | L0102 | |
DMEM/F12 w L-glutamine | Fisher Scientific | 15373541 | |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Dilution: 1/500 |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | Dilution: 1/500 |
DPBS w/o Calcium w/o Magnesium | TH.Geyer | L0615-500 | |
EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC) | Thermo Fisher Scientific | 710524 | Dilution: 1/500 |
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Carl Roth | CN06.3 | |
Falcon Tube 15 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 188271-N | |
Falcon Tube 50 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 227261 | |
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
FlowJo V10.8.2 | FlowJo | 663441 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-1KG | |
Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413301 | |
GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
Heracell™ 240i CO2 incubator | Fisher Scientific | 16416639 | |
Heraeus HeraSafe safety cabinet | Kendro | 51017905 | |
Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-749 | |
ImageJ | Fiji | Version 2.9.0 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL | Nerbe Plus | 04-212-1000 | |
Microscope Nikon eclipse TE2000-S | Nikon | TE2000-S | |
Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody | R&D Systems | MAB1368 | Dilution: 1/100 |
Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody | R&D Systems | MAB1420 | Dilution: 1/100 |
Mouse anti-beta-III Tubulin antibody | R&D Systems | MAB1195 | Dilution: 1/100 |
mTeSR™ 1 | STEMCELL Technolgies | 85850 | |
Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4903S | Dilution: 1/400 |
Normocure™ (Antimicrobial Reagent) | Invivogen | ant-noc | |
Oct-4 Rabbit Antibody | Cell Signaling Technology | 2750S | Dilution: 1/400 |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin. |
Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
Recombinant Human PDGF-AB | PeproTech | 100-00AB | |
Refrigerated benchtop centrifuge | SIGMA | 4-16KS | |
Renal Epithelial Cell Basal Medium | ATCC | PCS-400-030 | |
Renal Epithelial Cell Growth Kit | ATCC | PCS-400-040 | |
Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900 | Cell Signaling Technology | 4900S | Dilution: 1/400 |
SSEA4 (MC813) Mouse mAb | NEB | 4755S | Dilution: 1/500 |
StemFit® Basic02 | Nippon Genetics | 3821.00 | The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12563011 | |
Waterbath Precision GP 05 | Thermo Fisher Scientific | TSGP05 | |
Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor) | Biozol | BYT-ORB153635 | |
Antibody dilution buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
Blocking buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
REMC medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
Primary urine medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
PSC culture medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
PSC generation medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
Urine wash buffer | For composition see the supplementary table S1 |