Le présent protocole décrit une méthode pour isoler, étendre et reprogrammer des cellules dérivées de l’urine de primates humains et non humains en cellules souches pluripotentes induites (CSPi), ainsi que des instructions pour le maintien sans alimentation des CSPi nouvellement générées.
Les approches interspécifiques qui étudient les cellules souches pluripotentes des primates et leurs dérivés sont cruciales pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires de la maladie, du développement et de l’évolution. Pour rendre les cellules souches pluripotentes induites par les primates (CSPi) plus accessibles, cet article présente une méthode non invasive pour générer des CSPi de primates humains et non humains à partir de cellules dérivées de l’urine, et leur maintien à l’aide d’une méthode de culture sans nourrisseur.
L’urine peut être échantillonnée dans un environnement non stérile (p. ex. la cage de l’animal) et traitée avec un cocktail d’antibiotiques à large spectre pendant la culture cellulaire primaire afin de réduire efficacement la contamination. Après multiplication des cellules dérivées de l’urine, les CSPi sont générées par une méthode de transduction modifiée d’un système vectoriel du virus Sendai disponible dans le commerce. Les premières colonies d’iPSC peuvent déjà être visibles après 5 jours, et peuvent être cueillies après 10 jours au plus tôt. Le passage systématique d’amas avec tampon de dissociation sans enzyme soutient la pluripotence des CSPi générées pendant plus de 50 passages.
Les comparaisons génomiques des primates humains et non humains (PNH) sont cruciales pour comprendre notre histoire évolutive et l’évolution des traits spécifiques à l’homme1. De plus, ces comparaisons permettent d’inférer la fonction en identifiant les séquences d’ADN conservées2, par exemple, pour prioriser les variantes associées à la maladie3. Les comparaisons de phénotypes moléculaires tels que les niveaux d’expression génique sont cruciales pour mieux interpréter les comparaisons génomiques et découvrir, par exemple, les différences phénotypiques cellulaires. En outre, ils ont – comme les comparaisons au niveau de l’ADN – le potentiel de déduire la pertinence fonctionnelle, et donc de mieux interpréter la variation médicalement pertinente chez l’homme4. L’incorporation de données phénotypiques moléculaires complètes dans ces études comparatives nécessite des ressources biologiques appropriées (c.-à-d. des cellules orthologues pour toutes les espèces). Cependant, des raisons éthiques et pratiques rendent difficile, voire impossible, l’accès à ces cellules comparables, en particulier pendant le développement. Les cellules souches pluripotentes induites (CSPi) permettent la génération de tels types de cellules inaccessibles in vitro5,6, sont expérimentalement accessibles et ont été utilisées pour des comparaisons avec les primates 6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Pour générer des CSPi, il faut acquérir les cellules primaires à reprogrammer. Les cellules isolées de l’urine ont l’avantage de pouvoir être prélevées de manière non invasive chez les primates et de pouvoir être facilement reprogrammées, probablement en raison de leurs profils moléculaires semblables à ceux des cellules souches15. Les conditions de culture pour maintenir les CSPi des primates sont aussi importantes que la reprogrammation; Classiquement, la culture de cellules souches pluripotentes humaines nécessitait un milieu non défini à base de sérum et une co-culture de fibroblastes embryonnaires de souris – appelés cellules nourricières – qui fournissent des nutriments essentiels et un échafaudage pour les cellules souches embryonnaires (CSE)16. Depuis la mise au point de systèmes de culture chimiquement définis et sans alimentation17,18, il existe maintenant diverses options de milieux et de matrices de culture iPSC disponibles dans le commerce. Cependant, la plupart de ces conditions de culture ont été optimisées pour les CSE et les CSPi humaines et, par conséquent, pourraient moins bien fonctionner dans la culture des CSPi des PSN. Dans ce protocole vidéo, nous fournissons des instructions pour générer et maintenir des CSPi humaines et de PSP de PSN dérivées de cultures de cellules urinaires.
Depuis le premier rapport de génération de CSPi par l’expression forcée de facteurs définis dans les fibroblastes en 2006, cette méthode a été appliquée à de nombreux types cellulaires différents d’origines diverses 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. Parmi eux, seules les cellules dérivées de l’urine peuvent être obtenues de manière totalement non invasive. Sur la base du protocole précédemment décrit par Zhou et al.33, on peut isoler et développer des cellules à partir d’urine de primates même à partir d’échantillons non stériles, en complétant des antibiotiques à large spectre15. Notamment, les cellules dérivées de l’urine échantillonnées par ce protocole présentent un potentiel élevé de production de CSPi, dans un laps de temps plus court (les colonies deviennent visibles en 5-15 jours) que la reprogrammation conventionnelle des fibroblastes (20-30 jours, selon notre expérience), et avec un taux de réussite suffisamment élevé. Ces cellules dérivées de l’urine ont été classées comme la population mixte de cellules souches mésenchymateuses et de cellules épithéliales de la vessie, provoquant une efficacité de reprogrammation élevée15.
En plus de la variation des cellules primaires, les méthodes de reprogrammation pour générer des CSPi varient également en fonction du but de l’utilisation. Les procédures conventionnelles de reprogrammation des cellules somatiques humaines ont été réalisées par la surexpression de facteurs de reprogrammation avec des vecteurs rétrovirus ou lentivirus, ce qui a permis l’intégration de l’ADN exogène dans le génome 5,34,35. Pour garder les CSPi générées génomiquement intactes, les chercheurs ont mis au point une grande variété de systèmes de non-intégration – vecteur PiggyBac36,37 excisable, vecteur épisomique38,39, vecteurs de virus non intégrateurs tels que le virus Sendai 40 et l’adénovirus 41, transfection d’ARNm 42, transfection de protéines 43,44 et traitement de composés chimiques 45. En raison de l’efficacité et de la facilité de manipulation, les vecteurs de reprogrammation basés sur le virus Sendai sont utilisés dans ce protocole. L’infection des cellules primaires est réalisée dans une culture en suspension de cellules et de virus de 1 h à une multiplicité d’infection (MOI) de 5 avant le placage. Cette étape modifiée pourrait augmenter la probabilité de contact entre les surfaces cellulaires et les virus, par rapport à la méthode conventionnelle dans laquelle les virus sont ajoutés directement à la culture cellulaire adhérente, et ainsi produire plus de colonies de CSPi15.
La transmission des cellules souches pluripotentes humaines et des PSN peut se faire par passage d’agglomérats et par passage unicellulaire. L’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) est un agent chélatant rentable qui lie les ions calcium et magnésium et empêche ainsi l’activité adhérente de la cadhérine et de l’intégrine. L’EDTA est également utilisé comme réactif de dissociation sélectif et léger, car les cellules indifférenciées se détachent devant les cellules différenciées en raison de leurs différentes molécules d’adhésion. La dissociation complète induit la mort cellulaire massive des CSPi des primates via l’hyperactivation de la myosine médiée par la bobine enroulée associée à Rho / Rho contenant la protéine kinase (Rho / Rock). Par conséquent, la supplémentation du milieu de culture avec un inhibiteur de Rho/Rock est essentielle pour les expériences qui nécessitent des cellules individuelles en suspension46,47. Dans ce protocole, nous recommandons le passage par agrégats comme méthode de passage de routine et recommandons le passage d’une seule cellule uniquement lorsque cela est nécessaire, par exemple lorsque l’ensemencement de numéros de cellules définis est nécessaire, ou pendant le sous-clonage.
Les CSPi sont des types cellulaires précieux car ils permettent la génération de types cellulaires autrement inaccessibles in vitro. Comme les matériaux de départ pour la reprogrammation, par exemple, les fibroblastes ne sont pas facilement disponibles chez toutes les espèces de primates, cet article présente un protocole pour la génération de CSPi à partir de cellules dérivées de l’urine. Ces cellules peuvent être obtenues de manière non invasive, même à partir d’échantillons d’urine de p…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par DFG EN 1093/5-1 (numéro de projet 458247426). M.O. a été soutenu par JSPS Overseas Research Fellowship. Toutes les figurines ont été créées avec BioRender.com. La cytométrie en flux a été réalisée avec l’aide de la cytométrie en flux de l’installation centrale du centre biomédical de Munich. Nous tenons à remercier Makoto Shida et Tomoyo Muto de l’ASHBi, Université de Kyoto, pour leur soutien à la vidéographie.
Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution) | Sigma-Aldrich | SCR006 | |
Amphotericin B-Solution | Merck | A2941-100ML | |
Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody | Stem Cell Technologies | 60064 | Dilution: 1/200 |
Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody | Miltenyi Biotec | 130-122-965 | Dilution: 1/50 |
Bambanker™ (Cell freezing medium) | Nippon Genetics | BB01 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR | Greiner BIO-ONE | 665180 | |
Countess™ II automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes) | Sued-Laborbedarf | 52 95-0213 | Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information. |
CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) | Thermo Fisher Scientific | A16519 | |
CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit) | Thermo Fisher Scientific | A16518 | |
DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | 10236276001 | |
DMEM High Glucose | TH.Geyer | L0102 | |
DMEM/F12 w L-glutamine | Fisher Scientific | 15373541 | |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Dilution: 1/500 |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | Dilution: 1/500 |
DPBS w/o Calcium w/o Magnesium | TH.Geyer | L0615-500 | |
EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC) | Thermo Fisher Scientific | 710524 | Dilution: 1/500 |
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Carl Roth | CN06.3 | |
Falcon Tube 15 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 188271-N | |
Falcon Tube 50 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 227261 | |
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
FlowJo V10.8.2 | FlowJo | 663441 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-1KG | |
Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413301 | |
GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
Heracell™ 240i CO2 incubator | Fisher Scientific | 16416639 | |
Heraeus HeraSafe safety cabinet | Kendro | 51017905 | |
Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-749 | |
ImageJ | Fiji | Version 2.9.0 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL | Nerbe Plus | 04-212-1000 | |
Microscope Nikon eclipse TE2000-S | Nikon | TE2000-S | |
Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody | R&D Systems | MAB1368 | Dilution: 1/100 |
Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody | R&D Systems | MAB1420 | Dilution: 1/100 |
Mouse anti-beta-III Tubulin antibody | R&D Systems | MAB1195 | Dilution: 1/100 |
mTeSR™ 1 | STEMCELL Technolgies | 85850 | |
Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4903S | Dilution: 1/400 |
Normocure™ (Antimicrobial Reagent) | Invivogen | ant-noc | |
Oct-4 Rabbit Antibody | Cell Signaling Technology | 2750S | Dilution: 1/400 |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin. |
Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
Recombinant Human PDGF-AB | PeproTech | 100-00AB | |
Refrigerated benchtop centrifuge | SIGMA | 4-16KS | |
Renal Epithelial Cell Basal Medium | ATCC | PCS-400-030 | |
Renal Epithelial Cell Growth Kit | ATCC | PCS-400-040 | |
Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900 | Cell Signaling Technology | 4900S | Dilution: 1/400 |
SSEA4 (MC813) Mouse mAb | NEB | 4755S | Dilution: 1/500 |
StemFit® Basic02 | Nippon Genetics | 3821.00 | The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12563011 | |
Waterbath Precision GP 05 | Thermo Fisher Scientific | TSGP05 | |
Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor) | Biozol | BYT-ORB153635 | |
Antibody dilution buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
Blocking buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
REMC medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
Primary urine medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
PSC culture medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
PSC generation medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
Urine wash buffer | For composition see the supplementary table S1 |