Production et maintien de cellules souches pluripotentes induites par les primates dérivées de l’urine

Summary

Le présent protocole décrit une méthode pour isoler, étendre et reprogrammer des cellules dérivées de l’urine de primates humains et non humains en cellules souches pluripotentes induites (CSPi), ainsi que des instructions pour le maintien sans alimentation des CSPi nouvellement générées.

Abstract

Les approches interspécifiques qui étudient les cellules souches pluripotentes des primates et leurs dérivés sont cruciales pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires de la maladie, du développement et de l’évolution. Pour rendre les cellules souches pluripotentes induites par les primates (CSPi) plus accessibles, cet article présente une méthode non invasive pour générer des CSPi de primates humains et non humains à partir de cellules dérivées de l’urine, et leur maintien à l’aide d’une méthode de culture sans nourrisseur.

L’urine peut être échantillonnée dans un environnement non stérile (p. ex. la cage de l’animal) et traitée avec un cocktail d’antibiotiques à large spectre pendant la culture cellulaire primaire afin de réduire efficacement la contamination. Après multiplication des cellules dérivées de l’urine, les CSPi sont générées par une méthode de transduction modifiée d’un système vectoriel du virus Sendai disponible dans le commerce. Les premières colonies d’iPSC peuvent déjà être visibles après 5 jours, et peuvent être cueillies après 10 jours au plus tôt. Le passage systématique d’amas avec tampon de dissociation sans enzyme soutient la pluripotence des CSPi générées pendant plus de 50 passages.

Introduction

Les comparaisons génomiques des primates humains et non humains (PNH) sont cruciales pour comprendre notre histoire évolutive et l’évolution des traits spécifiques à l’homme¹. De plus, ces comparaisons permettent d’inférer la fonction en identifiant les séquences d’ADN conservées², par exemple, pour prioriser les variantes associées à la maladie³. Les comparaisons de phénotypes moléculaires tels que les niveaux d’expression génique sont cruciales pour mieux interpréter les comparaisons génomiques et découvrir, par exemple, les différences phénotypiques cellulaires. En outre, ils ont – comme les comparaisons au niveau de l’ADN – le potentiel de déduire la pertinence fonctionnelle, et donc de mieux interpréter la variation médicalement pertinente chez l’homme⁴. L’incorporation de données phénotypiques moléculaires complètes dans ces études comparatives nécessite des ressources biologiques appropriées (c.-à-d. des cellules orthologues pour toutes les espèces). Cependant, des raisons éthiques et pratiques rendent difficile, voire impossible, l’accès à ces cellules comparables, en particulier pendant le développement. Les cellules souches pluripotentes induites (CSPi) permettent la génération de tels types de cellules inaccessibles in vitro^5,6, sont expérimentalement accessibles et ont été utilisées pour des comparaisons avec les primates 6,7,8,9,10,11,12,13,14.

Pour générer des CSPi, il faut acquérir les cellules primaires à reprogrammer. Les cellules isolées de l’urine ont l’avantage de pouvoir être prélevées de manière non invasive chez les primates et de pouvoir être facilement reprogrammées, probablement en raison de leurs profils moléculaires semblables à ceux des cellules souches¹⁵. Les conditions de culture pour maintenir les CSPi des primates sont aussi importantes que la reprogrammation; Classiquement, la culture de cellules souches pluripotentes humaines nécessitait un milieu non défini à base de sérum et une co-culture de fibroblastes embryonnaires de souris – appelés cellules nourricières – qui fournissent des nutriments essentiels et un échafaudage pour les cellules souches embryonnaires (CSE)¹⁶. Depuis la mise au point de systèmes de culture chimiquement définis et sans alimentation^17,18, il existe maintenant diverses options de milieux et de matrices de culture iPSC disponibles dans le commerce. Cependant, la plupart de ces conditions de culture ont été optimisées pour les CSE et les CSPi humaines et, par conséquent, pourraient moins bien fonctionner dans la culture des CSPi des PSN. Dans ce protocole vidéo, nous fournissons des instructions pour générer et maintenir des CSPi humaines et de PSP de PSN dérivées de cultures de cellules urinaires.

Depuis le premier rapport de génération de CSPi par l’expression forcée de facteurs définis dans les fibroblastes en 2006, cette méthode a été appliquée à de nombreux types cellulaires différents d’origines diverses 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ^,32. Parmi eux, seules les cellules dérivées de l’urine peuvent être obtenues de manière totalement non invasive. Sur la base du protocole précédemment décrit par Zhou et ^al.33, on peut isoler et développer des cellules à partir d’urine de primates même à partir d’échantillons non stériles, en complétant des antibiotiques à large spectre¹⁵. Notamment, les cellules dérivées de l’urine échantillonnées par ce protocole présentent un potentiel élevé de production de CSPi, dans un laps de temps plus court (les colonies deviennent visibles en 5-15 jours) que la reprogrammation conventionnelle des fibroblastes (20-30 jours, selon notre expérience), et avec un taux de réussite suffisamment élevé. Ces cellules dérivées de l’urine ont été classées comme la population mixte de cellules souches mésenchymateuses et de cellules épithéliales de la vessie, provoquant une efficacité de reprogrammation élevée¹⁵.

En plus de la variation des cellules primaires, les méthodes de reprogrammation pour générer des CSPi varient également en fonction du but de l’utilisation. Les procédures conventionnelles de reprogrammation des cellules somatiques humaines ont été réalisées par la surexpression de facteurs de reprogrammation avec des vecteurs rétrovirus ou lentivirus, ce qui a permis l’intégration de l’ADN exogène dans le génome 5,34,35. Pour garder les CSPi générées génomiquement intactes, les chercheurs ont mis au point une grande variété de systèmes de non-intégration – vecteur PiggyBac^36,37 excisable, vecteur épisomique^38,39, vecteurs de virus non intégrateurs tels que le virus Sendai 40 et l’adénovirus 41, transfection d’ARNm 42, transfection de protéines ^43,44 et traitement de composés chimiques ⁴⁵. En raison de l’efficacité et de la facilité de manipulation, les vecteurs de reprogrammation basés sur le virus Sendai sont utilisés dans ce protocole. L’infection des cellules primaires est réalisée dans une culture en suspension de cellules et de virus de 1 h à une multiplicité d’infection (MOI) de 5 avant le placage. Cette étape modifiée pourrait augmenter la probabilité de contact entre les surfaces cellulaires et les virus, par rapport à la méthode conventionnelle dans laquelle les virus sont ajoutés directement à la culture cellulaire adhérente, et ainsi produire plus de colonies de CSPi¹⁵.

La transmission des cellules souches pluripotentes humaines et des PSN peut se faire par passage d’agglomérats et par passage unicellulaire. L’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) est un agent chélatant rentable qui lie les ions calcium et magnésium et empêche ainsi l’activité adhérente de la cadhérine et de l’intégrine. L’EDTA est également utilisé comme réactif de dissociation sélectif et léger, car les cellules indifférenciées se détachent devant les cellules différenciées en raison de leurs différentes molécules d’adhésion. La dissociation complète induit la mort cellulaire massive des CSPi des primates via l’hyperactivation de la myosine médiée par la bobine enroulée associée à Rho / Rho contenant la protéine kinase (Rho / Rock). Par conséquent, la supplémentation du milieu de culture avec un inhibiteur de Rho/Rock est essentielle pour les expériences qui nécessitent des cellules individuelles en suspension^46,47. Dans ce protocole, nous recommandons le passage par agrégats comme méthode de passage de routine et recommandons le passage d’une seule cellule uniquement lorsque cela est nécessaire, par exemple lorsque l’ensemencement de numéros de cellules définis est nécessaire, ou pendant le sous-clonage.

Protocol

Cette procédure expérimentale a été approuvée par le comité d’éthique responsable de l’expérimentation humaine (20-122, Ethikkommission LMU München). Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives et réglementations pertinentes.REMARQUE : L’approbation du comité d’éthique approprié doit être obtenue avant d’entreprendre des expériences portant sur des échantillons humains et des échantillons de PSN. Toutes les procédures expérimentales doivent être effectuées…

Representative Results

Lors de l’isolement de cellules de l’urine humaine et de l’urine de PSN, différents types de cellules peuvent être identifiés directement après l’isolement. Les cellules squameuses, ainsi que diverses cellules rondes plus petites, sont excrétées avec l’urine; l’urine féminine contient beaucoup plus de cellules malpighiennes que l’urine masculine (Figure 1B – Jour 0; Figure supplémentaire S1). Après 5 jours de culture dans un milieu urinaire primaire, l…

Discussion

Les CSPi sont des types cellulaires précieux car ils permettent la génération de types cellulaires autrement inaccessibles in vitro. Comme les matériaux de départ pour la reprogrammation, par exemple, les fibroblastes ne sont pas facilement disponibles chez toutes les espèces de primates, cet article présente un protocole pour la génération de CSPi à partir de cellules dérivées de l’urine. Ces cellules peuvent être obtenues de manière non invasive, même à partir d’échantillons d’urine de p…

Materials

Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution)	Sigma-Aldrich	SCR006
Amphotericin B-Solution	Merck	A2941-100ML
Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody	Stem Cell Technologies	60064	Dilution: 1/200
Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody	Miltenyi Biotec	130-122-965	Dilution: 1/50
Bambanker™ (Cell freezing medium)	Nippon Genetics	BB01
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059-100G
Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR	Greiner BIO-ONE	665180
Countess™ II automated cell counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes)	Sued-Laborbedarf	52 95-0213	Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information.
CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus)	Thermo Fisher Scientific	A16519
CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit)	Thermo Fisher Scientific	A16518
DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride	Sigma-Aldrich	10236276001
DMEM High Glucose	TH.Geyer	L0102
DMEM/F12 w L-glutamine	Fisher Scientific	15373541
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488	Thermo Fisher Scientific	A-21202	Dilution: 1/500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594	Thermo Fisher Scientific	A-21207	Dilution: 1/500
DPBS w/o Calcium w/o Magnesium	TH.Geyer	L0615-500
EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC)	Thermo Fisher Scientific	710524	Dilution: 1/500
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)	Carl Roth	CN06.3
Falcon Tube 15 mL conical bottom	Greiner BIO-ONE	188271-N
Falcon Tube 50 mL conical bottom	Greiner BIO-ONE	227261
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS)	Thermo Fisher Scientific	10500064
FlowJo V10.8.2	FlowJo	663441
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890-1KG
Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	Thermo Fisher Scientific	A1413301
GlutaMAX™ Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050038
Heracell™ 240i CO2 incubator	Fisher Scientific	16416639
Heraeus HeraSafe safety cabinet	Kendro	51017905
Human EGF, premium grade	Miltenyi Biotec	130-097-749
ImageJ	Fiji	Version 2.9.0
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Thermo Fisher Scientific	11140035
Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL	Nerbe Plus	04-212-1000
Microscope Nikon eclipse TE2000-S	Nikon	TE2000-S
Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody	R&D Systems	MAB1368	Dilution: 1/100
Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody	R&D Systems	MAB1420	Dilution: 1/100
Mouse anti-beta-III Tubulin antibody	R&D Systems	MAB1195	Dilution: 1/100
mTeSR™ 1	STEMCELL Technolgies	85850
Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	4903S	Dilution: 1/400
Normocure™ (Antimicrobial Reagent)	Invivogen	ant-noc
Oct-4 Rabbit Antibody	Cell Signaling Technology	2750S	Dilution: 1/400
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	441244-1KG
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS)	Thermo Fisher Scientific	15140122	Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin.
Recombinant Human FGF-basic	PeproTech	100-18B
Recombinant Human PDGF-AB	PeproTech	100-00AB
Refrigerated benchtop centrifuge	SIGMA	4-16KS
Renal Epithelial Cell Basal Medium	ATCC	PCS-400-030
Renal Epithelial Cell Growth Kit	ATCC	PCS-400-040
Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900	Cell Signaling Technology	4900S	Dilution: 1/400
SSEA4 (MC813) Mouse mAb	NEB	4755S	Dilution: 1/500
StemFit® Basic02	Nippon Genetics	3821.00	The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme)	Thermo Fisher Scientific	12563011
Waterbath Precision GP 05	Thermo Fisher Scientific	TSGP05
Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor)	Biozol	BYT-ORB153635
Antibody dilution buffer			For composition see the supplementary table S1
Blocking buffer			For composition see the supplementary table S1
REMC medium			For composition see the supplementary table S1
Primary urine medium			For composition see the supplementary table S1
PSC culture medium			For composition see the supplementary table S1
PSC generation medium			For composition see the supplementary table S1
Urine wash buffer			For composition see the supplementary table S1