Erzeugung und Erhaltung von Primaten-induzierten pluripotenten Stammzellen aus Urin
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung, Expansion und Reprogrammierung von humanen und nicht-humanen Zellen aus dem Urin von Primaten zu induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) sowie Anweisungen zur feederfreien Aufrechterhaltung der neu erzeugten iPS-Zellen.
Abstract
Speziesübergreifende Ansätze zur Untersuchung pluripotenter Stammzellen von Primaten und ihrer Derivate sind von entscheidender Bedeutung, um die molekularen und zellulären Mechanismen von Krankheit, Entwicklung und Evolution besser zu verstehen. Um den Zugang zu Primaten-induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) zu erleichtern, wird in dieser Arbeit eine nicht-invasive Methode zur Erzeugung von humanen und nicht-humanen Primaten-iPS-Zellen aus aus aus dem Urin gewonnenen Zellen und deren Erhaltung mit einer feederfreien Kultivierungsmethode vorgestellt.
Der Urin kann aus einer unsterilen Umgebung (z. B. dem Käfig des Tieres) entnommen und während der primären Zellkultur mit einem Breitband-Antibiotika-Cocktail behandelt werden, um die Kontamination effizient zu reduzieren. Nach der Vermehrung der aus dem Urin gewonnenen Zellen werden iPS-Zellen durch eine modifizierte Transduktionsmethode eines kommerziell erhältlichen Sendai-Virus-Vektorsystems erzeugt. Erste iPSC-Kolonien können bereits nach 5 Tagen sichtbar sein und frühestens nach 10 Tagen gepflückt werden. Die routinemäßige Klumpenpassage mit enzymfreiem Dissoziationspuffer unterstützt die Pluripotenz der erzeugten iPSCs für mehr als 50 Passagen.
Introduction
Genomische Vergleiche von menschlichen und nicht-menschlichen Primaten (NHPs) sind entscheidend, um unsere Evolutionsgeschichte und die Evolution menschenspezifischer Merkmale zu verstehen1. Darüber hinaus ermöglichen diese Vergleiche den Rückschluss auf die Funktion durch die Identifizierung konservierter DNA-Sequenzen2, z. B. um krankheitsassoziierte Varianten3 zu priorisieren. Vergleiche von molekularen Phänotypen, wie z.B. Genexpressionsniveaus, sind entscheidend, um genomische Vergleiche besser interpretieren zu können und z.B. zelluläre phänotypische Unterschiede zu entdecken. Darüber hinaus haben sie – ähnlich wie Vergleiche auf DNA-Ebene – das Potenzial, auf funktionelle Relevanz zu schließen und damit medizinisch relevante Variationen innerhalb des Menschen besser zu interpretieren4. Die Einbeziehung umfassender molekularphänotypischer Daten in diese Vergleichsstudien erfordert geeignete biologische Ressourcen (d.h. orthologe Zellen über Spezies hinweg). Ethische und praktische Gründe erschweren oder verunmöglichen jedoch den Zugang zu solchen vergleichbaren Zellen, insbesondere während der Entwicklung. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) ermöglichen die Generierung solcher unzugänglichen Zelltypen in vitro5,6, sind experimentell zugänglich und wurden für Primatenvergleicheverwendet 6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Um iPS-Zellen zu erzeugen, muss man die Primärzellen erfassen, die neu programmiert werden sollen. Aus Urin isolierte Zellen haben den Vorteil, dass sie nicht-invasiv von Primaten entnommen werden können und dass sie leicht umprogrammiert werden können, wahrscheinlich aufgrund ihrer stammzellähnlichen molekularen Profile15. Die Kulturbedingungen für die Erhaltung von Primaten-iPS-Zellen sind ebenso wichtig wie die Reprogrammierung. Klassischerweise erforderte die Kultivierung menschlicher pluripotenter Stammzellen ein nicht definiertes, serumbasiertes Medium und eine Kokultur von embryonalen Fibroblasten der Maus – sogenannten Feederzellen -, die essentielle Nährstoffe und ein Gerüst für embryonale Stammzellen (ESCs) liefern16. Seit der Entwicklung chemisch definierter und feederfreier Kultursysteme17,18 gibt es heute verschiedene Optionen für kommerziell erhältliche iPSC-Nährmedien und -Matrices. Die meisten dieser Kulturbedingungen wurden jedoch für humane ES-Zellen und iPS-Zellen optimiert und funktionieren daher möglicherweise weniger gut in der NHP-iPSC-Kultur. In diesem Videoprotokoll geben wir Anweisungen zur Erzeugung und Pflege von humanen und NHP-iPS-Zellen, die aus Zellkulturen im Urin gewonnen werden.
Seit dem ersten Bericht über die Erzeugung von iPS-Zellen durch die erzwungene Expression definierter Faktoren in Fibroblasten im Jahr 2006 wurde diese Methode auf viele verschiedene Zelltypen unterschiedlicher Herkunft angewendet 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. Von ihnen können nur aus Urin gewonnene Zellen auf völlig nicht-invasive Weise gewonnen werden. Basierend auf dem zuvor beschriebenen Protokoll von Zhou et al.33 kann man Zellen aus Primatenurin auch aus unsterilen Proben isolieren und expandieren, indem man Breitbandantibiotika ergänzt15. Bemerkenswert ist, dass Urinzellen, die mit diesem Protokoll beprobt wurden, ein hohes Potenzial zur Produktion von iPS-Zellen aufweisen, und zwar innerhalb eines kürzeren Zeitraums (Kolonien werden in 5-15 Tagen sichtbar) als die herkömmliche Reprogrammierung von Fibroblasten (20-30 Tage, unserer Erfahrung nach) und mit einer ausreichend hohen Erfolgsrate. Diese aus dem Urin gewonnenen Zellen wurden als gemischte Population von mesenchymalen Stammzell-ähnlichen Zellen und Blasenepithelzellen klassifiziert, was die hohe Reprogrammierungseffizienz verursacht15.
Neben der Variation in den Primärzellen variieren auch die Reprogrammierungsmethoden zur Erzeugung von iPS-Zellen je nach Verwendungszweck. Konventionelle Reprogrammierungsverfahren für menschliche somatische Zellen wurden durch die Überexpression von Reprogrammierungsfaktoren mit Retrovirus- oder Lentivirus-Vektoren durchgeführt, was die Integration exogener DNA in das Genom ermöglichte 5,34,35. Um die erzeugten iPS-Zellen genomisch intakt zu halten, haben die Forscher eine Vielzahl von Nicht-Integrationssystemen entwickelt – den exzisierbaren PiggyBac-Vektor 36,37, den episomalen Vektor38,39, nicht-integrierende Virusvektoren wie das Sendai-Virus 40 und das Adenovirus 41, die mRNA-Transfektion 42, die Proteintransfektion 43,44 und die Behandlung mit chemischen Verbindungen 45. Aufgrund der Effizienz und einfachen Handhabung werden in diesem Protokoll die auf dem Sendai-Virus basierenden Reprogrammierungsvektoren verwendet. Die Infektion der Primärzellen erfolgt in einer 1-stündigen Suspensionskultur von Zellen und Viren bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 5 vor der Plattierung. Dieser modifizierte Schritt könnte die Wahrscheinlichkeit eines Kontakts zwischen Zelloberflächen und Viren im Vergleich zu der herkömmlichen Methode, bei der die Viren direkt in die adhärente Zellkultur gegeben werden, erhöhen und so mehr iPSC-Kolonien ergeben15.
Die Passage von humanen und NHP-pluripotenten Stammzellen kann durch Klumpen- und Einzelzellpassage erfolgen. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) ist ein kostengünstiger Chelatbildner, der Calcium- und Magnesiumionen bindet und so die Adhärentaktivität von Cadherin und Integrin verhindert. EDTA wird auch als mildes, selektives Dissoziationsreagenz verwendet, da sich undifferenzierte Zellen aufgrund ihrer unterschiedlichen Adhäsionsmoleküle vor differenzierten Zellen ablösen. Die vollständige Dissoziation induziert einen massiven Zelltod von Primaten-iPS-Zellen über die Rho/Rho-assoziierte Coiled-Coil-haltige Proteinkinase (Rho/Rock)-vermittelte Myosin-Hyperaktivierung. Daher ist die Ergänzung des Nährmediums mit einem Rho/Rock-Inhibitor für Experimente, die Einzelzellen in Suspension erfordern, unerlässlich46,47. In diesem Protokoll empfehlen wir die Klumpenpassage als routinemäßige Passaging-Methode und empfehlen die Einzelzell-Passage nur, wenn dies erforderlich ist, z. B. wenn das Seeding definierter Zellzahlen erforderlich ist, oder während der Subklonen.
Protocol
Representative Results
Discussion
iPS-Zellen sind wertvolle Zelltypen, da sie die Erzeugung von sonst unzugänglichen Zelltypen in vitro ermöglichen. Da die Ausgangsmaterialien für die Reprogrammierung, z.B. Fibroblasten, nicht von allen Primatenarten leicht verfügbar sind, wird in dieser Arbeit ein Protokoll für die Generierung von iPS-Zellen aus Urinzellen vorgestellt. Diese Zellen können nicht-invasiv gewonnen werden, auch aus unsterilen Urinproben von Primaten, indem das Nährmedium mit Breitbandantibiotika ergänzt wird.
<p class="…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der DFG EN 1093/5-1 (Projektnummer 458247426) gefördert. M.O. wurde durch das JSPS Overseas Research Fellowship unterstützt. Alle Figuren wurden mit BioRender.com erstellt. Die Durchflusszytometrie wurde mit Hilfe der Core Facility Durchflusszytometrie am Biomedizinischen Zentrum München durchgeführt. Wir bedanken uns bei Makoto Shida und Tomoyo Muto von der ASHBi, Kyoto University, für die Unterstützung der Videografie.
Materials
| Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution) | Sigma-Aldrich | SCR006 | |
| Amphotericin B-Solution | Merck | A2941-100ML | |
| Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody | Stem Cell Technologies | 60064 | Dilution: 1/200 |
| Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody | Miltenyi Biotec | 130-122-965 | Dilution: 1/50 |
| Bambanker™ (Cell freezing medium) | Nippon Genetics | BB01 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
| Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR | Greiner BIO-ONE | 665180 | |
| Countess™ II automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes) | Sued-Laborbedarf | 52 95-0213 | Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information. |
| CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) | Thermo Fisher Scientific | A16519 | |
| CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit) | Thermo Fisher Scientific | A16518 | |
| DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | 10236276001 | |
| DMEM High Glucose | TH.Geyer | L0102 | |
| DMEM/F12 w L-glutamine | Fisher Scientific | 15373541 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Dilution: 1/500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | Dilution: 1/500 |
| DPBS w/o Calcium w/o Magnesium | TH.Geyer | L0615-500 | |
| EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC) | Thermo Fisher Scientific | 710524 | Dilution: 1/500 |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Carl Roth | CN06.3 | |
| Falcon Tube 15 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 188271-N | |
| Falcon Tube 50 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| FlowJo V10.8.2 | FlowJo | 663441 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-1KG | |
| Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413301 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Heracell™ 240i CO2 incubator | Fisher Scientific | 16416639 | |
| Heraeus HeraSafe safety cabinet | Kendro | 51017905 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-749 | |
| ImageJ | Fiji | Version 2.9.0 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL | Nerbe Plus | 04-212-1000 | |
| Microscope Nikon eclipse TE2000-S | Nikon | TE2000-S | |
| Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody | R&D Systems | MAB1368 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody | R&D Systems | MAB1420 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-beta-III Tubulin antibody | R&D Systems | MAB1195 | Dilution: 1/100 |
| mTeSR™ 1 | STEMCELL Technolgies | 85850 | |
| Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4903S | Dilution: 1/400 |
| Normocure™ (Antimicrobial Reagent) | Invivogen | ant-noc | |
| Oct-4 Rabbit Antibody | Cell Signaling Technology | 2750S | Dilution: 1/400 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin. |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Recombinant Human PDGF-AB | PeproTech | 100-00AB | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SIGMA | 4-16KS | |
| Renal Epithelial Cell Basal Medium | ATCC | PCS-400-030 | |
| Renal Epithelial Cell Growth Kit | ATCC | PCS-400-040 | |
| Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900 | Cell Signaling Technology | 4900S | Dilution: 1/400 |
| SSEA4 (MC813) Mouse mAb | NEB | 4755S | Dilution: 1/500 |
| StemFit® Basic02 | Nippon Genetics | 3821.00 | The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12563011 | |
| Waterbath Precision GP 05 | Thermo Fisher Scientific | TSGP05 | |
| Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor) | Biozol | BYT-ORB153635 | |
| Antibody dilution buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Blocking buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| REMC medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Primary urine medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC culture medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC generation medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Urine wash buffer | For composition see the supplementary table S1 |
References
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