मूत्र से प्राप्त प्राइमेट प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं का उत्पादन और रखरखाव
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल मानव और गैर-मानव प्राइमेट मूत्र-व्युत्पन्न कोशिकाओं को प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) के लिए अलग करने, विस्तार ति करने और पुन: प्रोग्राम करने की एक विधि का वर्णन करता है, साथ ही साथ नए उत्पन्न आईपीएससी के फीडर-मुक्त रखरखाव के लिए निर्देश भी देता है।
Abstract
प्राइमेट प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं और उनके डेरिवेटिव का अध्ययन करने वाले क्रॉस-प्रजाति दृष्टिकोण रोग, विकास और विकास के आणविक और सेलुलर तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं। प्राइमेट प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) को अधिक सुलभ बनाने के लिए, यह पेपर मूत्र-व्युत्पन्न कोशिकाओं से मानव और गैर-मानव प्राइमेट आईपीएससी उत्पन्न करने और फीडर-मुक्त संवर्धन विधि का उपयोग करके उनके रखरखाव के लिए एक गैर-इनवेसिव विधि प्रस्तुत करता है।
मूत्र को एक गैर-बाँझ वातावरण (जैसे, जानवर के पिंजरे) से नमूना लिया जा सकता है और संदूषण को कुशलतापूर्वक कम करने के लिए प्राथमिक सेल कल्चर के दौरान एक व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक कॉकटेल के साथ इलाज किया जा सकता है। मूत्र-व्युत्पन्न कोशिकाओं के प्रसार के बाद, आईपीएससी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेंडाई वायरस वेक्टर सिस्टम की एक संशोधित पारगमन विधि द्वारा उत्पन्न होते हैं। पहली आईपीएससी कॉलोनियां 5 दिनों के बाद पहले से ही दिखाई दे सकती हैं, और जल्द से जल्द 10 दिनों के बाद उठाई जा सकती हैं। एंजाइम-मुक्त पृथक्करण बफर के साथ नियमित क्लंप पासिंग 50 से अधिक मार्गों के लिए उत्पन्न आईपीएससी की प्लुरिपोटेंसी का समर्थन करता है।
Introduction
मानव और गैर-मानव प्राइमेट्स (एनएचपी) की जीनोमिक तुलना हमारे विकासवादी इतिहास और मानव-विशिष्ट लक्षणों के विकास को समझने के लिए महत्वपूर्णहै। इसके अतिरिक्त, ये तुलनासंरक्षित डीएनए अनुक्रम2 की पहचान करके फ़ंक्शन के अनुमान की अनुमति देती है, उदाहरण के लिए, रोग से जुड़े वेरिएंट3 को प्राथमिकता देने के लिए। जीन अभिव्यक्ति स्तर जैसे आणविक फेनोटाइप की तुलना जीनोमिक तुलना की बेहतर व्याख्या करने और उदाहरण के लिए, सेलुलर फेनोटाइपिक मतभेदों की खोज करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, उनके पास – डीएनए स्तर पर तुलना के समान – कार्यात्मक प्रासंगिकता का अनुमान लगाने की क्षमता है, और इसलिए मनुष्यों के भीतर चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक भिन्नता की बेहतर व्याख्या करने की क्षमताहै। इन तुलनात्मक अध्ययनों में व्यापक आणविक फेनोटाइपिक डेटा को शामिल करने के लिए उपयुक्त जैविक संसाधनों (यानी, प्रजातियों में ऑर्थोलॉगस कोशिकाओं) की आवश्यकता होती है। हालांकि, नैतिक और व्यावहारिक कारण ऐसी तुलनीय कोशिकाओं तक पहुंचना मुश्किल या असंभव बनाते हैं, खासकर विकास के दौरान। प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) विट्रो5,6 में ऐसे दुर्गम सेल प्रकारों की पीढ़ी के लिए अनुमति देते हैं, प्रयोगात्मक रूप से सुलभ हैं, और प्राइमेट तुलना6,7,8,9,10,11,12,13,14 के लिए उपयोग किया गया है।
आईपीएससी उत्पन्न करने के लिए, किसी को पुन: प्रोग्राम किए जाने के लिए प्राथमिक कोशिकाओं का अधिग्रहण करने की आवश्यकता होती है। मूत्र से अलग कोशिकाओं का लाभ यह है कि उन्हें प्राइमेट्स से गैर-आक्रामक रूप से नमूना लिया जा सकता है, और उन्हें आसानी से पुन: प्रोग्राम किया जा सकता है, शायद उनके स्टेम सेल जैसे आणविक प्रोफाइल15 के कारण। प्राइमेट आईपीएससी को बनाए रखने के लिए संस्कृति की स्थिति रीप्रोग्रामिंग के रूप में महत्वपूर्ण है; शास्त्रीय रूप से, मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं की संस्कृति के लिए माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट – तथाकथित फीडर कोशिकाओं के एक गैर-परिभाषित, सीरम-आधारित माध्यम और सह-संस्कृति की आवश्यकता होती है – जो भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ईएससी) 16 के लिए आवश्यक पोषक तत्व और एक मचान प्रदान करते हैं। रासायनिक रूप से परिभाषित और फीडर-मुक्त संस्कृति प्रणालियों17,18 के विकास के बाद से, अब व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आईपीएससी संस्कृति मीडिया और मैट्रिक्स के विभिन्न विकल्प हैं। हालांकि, इनमें से अधिकांश संस्कृति स्थितियों को मानव ईएससी और आईपीएससी के लिए अनुकूलित किया गया है, और इसलिए एनएचपी आईपीएससी संस्कृति में कम अच्छी तरह से काम कर सकता है। इस वीडियो प्रोटोकॉल में, हम मूत्र कोशिका संस्कृति से प्राप्त मानव और एनएचपी आईपीएससी उत्पन्न करने और बनाए रखने के निर्देश प्रदान करते हैं।
2006 में फाइब्रोब्लास्ट में परिभाषित कारकों की मजबूर अभिव्यक्ति द्वारा आईपीएससी पीढ़ी की पहली रिपोर्ट के बाद से, इस विधि को विभिन्न मूलके कई अलग-अलग सेल प्रकारों 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 पर लागू किया गया है।, 32. उनमें से, केवल मूत्र-व्युत्पन्न कोशिकाओं को पूरी तरह से गैर-आक्रामक तरीके से प्राप्त किया जा सकता है। झोउ एट अल .33 द्वारा पहले वर्णित प्रोटोकॉल के आधार पर, व्यापक स्पेक्ट्रमएंटीबायोटिक दवाओं के पूरक द्वारा गैर-बाँझ नमूनों से भी प्राइमेट मूत्र से कोशिकाओं को अलग और विस्तारित किया जा सकता है। विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल द्वारा नमूना किए गए मूत्र-व्युत्पन्न कोशिकाएं फाइब्रोब्लास्ट (हमारे अनुभव में 20-30 दिनों) की पारंपरिक रीप्रोग्रामिंग की तुलना में कम समय के भीतर आईपीएससी का उत्पादन करने की उच्च क्षमता प्रदर्शित करती हैं (कॉलोनियां 5-15 दिनों में दिखाई देती हैं), और पर्याप्त रूप से उच्च सफलता दर के साथ। इन मूत्र-व्युत्पन्न कोशिकाओं को मेसेनकाइमल स्टेम सेल जैसी कोशिकाओं और मूत्राशय उपकला कोशिकाओं की मिश्रित आबादी के रूप में वर्गीकृत किया गया था, जिससे उच्च रीप्रोग्रामिंग दक्षता15 हो गई।
प्राथमिक कोशिकाओं में भिन्नता के अलावा, आईपीएससी उत्पन्न करने के लिए रीप्रोग्रामिंग विधियां भी उपयोग के उद्देश्य के अनुसार भिन्न होती हैं। मानव दैहिक कोशिकाओं के लिए पारंपरिक रीप्रोग्रामिंग प्रक्रियाओं को रेट्रोवायरस या लेंटिवायरस वैक्टर के साथ रीप्रोग्रामिंग कारकों के ओवरएक्प्रेशन द्वारा किया गया था, जिसने जीनोम 5,34,35 में बहिर्जात डीएनए के एकीकरण की अनुमति दी थी। उत्पन्न आईपीएससी को जीनोमिक रूप से बरकरार रखने के लिए, शोधकर्ताओं ने विभिन्न प्रकार की गैर-एकीकरण प्रणालियों को विकसित किया है – एक्सिसेबल पिग्गीबैक वेक्टर 36,37, एपिसोमल वेक्टर38,39, गैर-एकीकृत वायरस वैक्टर जैसे सेंडाई वायरस 40 और एडेनोवायरस 41, एमआरएनए अभिकर्मक 42, प्रोटीन अभिकर्मक 43,44, और रासायनिक यौगिक उपचार 45।. हैंडलिंग में दक्षता और आसानी के कारण, इस प्रोटोकॉल में सेंडाई वायरस-आधारित रीप्रोग्रामिंग वैक्टर का उपयोग किया जाता है। प्राथमिक कोशिकाओं का संक्रमण चढ़ाना से पहले 5 की संक्रमण (एमओआई) की बहुलता पर कोशिकाओं और वायरस की 1 घंटे की निलंबन संस्कृति में किया जाता है। यह संशोधित कदम सेल सतहों और वायरस के बीच संपर्क की संभावना को बढ़ा सकता है, पारंपरिक विधि की तुलना में जिसमें वायरस को सीधे अनुयायी सेल संस्कृति में जोड़ा जाता है, और इस प्रकार अधिक आईपीएससी कॉलोनियां15 उत्पन्न होती हैं।
मानव और एनएचपी प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं की पासिंग क्लंप पासिंग और सिंगल-सेल पासिंग द्वारा की जा सकती है। एथिलीनडायमाइनटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) एक लागत कुशल चेलटिंग एजेंट है जो कैल्शियम और मैग्नीशियम आयनों को बांधता है, और इस प्रकार कैडरिन और इंटीग्रिन की अनुयायी गतिविधि को रोकता है। ईडीटीए का उपयोग हल्के, चयनात्मक पृथक्करण अभिकर्मक के रूप में भी किया जाता है, क्योंकि उदासीन कोशिकाएं अपने अलग-अलग आसंजन अणुओं के कारण विभेदित कोशिकाओं से पहले अलग हो जाती हैं। पूर्ण पृथक्करण प्रोटीन काइनेज (Rho/Rock)-मध्यस्थता मायोसिन हाइपरएक्टिवेशन युक्त Rho/Rho-संबद्ध कॉइल्ड-कॉइल के माध्यम से प्राइमेट आईपीएससी की बड़े पैमाने पर कोशिका मृत्यु को प्रेरित करता है। इसलिए, एक Rho / Rock अवरोधक के साथ संस्कृति माध्यम को पूरक करना उन प्रयोगों के लिए आवश्यक है जिनके लिए निलंबन46,47 में एकल कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल में, हम नियमित पासिंग विधि के रूप में क्लंप पासिंग की सलाह देते हैं और एकल-सेल पासिंग की सलाह केवल तभी देते हैं जब यह आवश्यक हो, उदाहरण के लिए, जब परिभाषित सेल नंबरों की सीडिंग की आवश्यकता होती है, या उप-क्लोनिंग के दौरान।
Protocol
Representative Results
Discussion
आईपीएससी मूल्यवान सेल प्रकार हैं क्योंकि वे विट्रो में अन्यथा दुर्गम सेल प्रकारों की पीढ़ी की अनुमति देते हैं। रीप्रोग्रामिंग के लिए शुरुआती सामग्री के रूप में, उदाहरण के लिए, फाइब्रोब्लास्ट सभी …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम डीएफजी ईएन 1093/5-1 (परियोजना संख्या 458247426) द्वारा समर्थित था। एमओ को जेएसपीएस ओवरसीज रिसर्च फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था। सभी आंकड़े BioRender.com के साथ बनाए गए थे। फ्लो साइटोमेट्री बायोमेडिकल सेंटर म्यूनिख में कोर फैसिलिटी फ्लो साइटोमेट्री की मदद से किया गया था। हम वीडियोग्राफी के समर्थन के लिए एएसएचबीआई, क्योटो विश्वविद्यालय से मकोतो शिदा और तोमोयो मुटो को धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution) | Sigma-Aldrich | SCR006 | |
| Amphotericin B-Solution | Merck | A2941-100ML | |
| Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody | Stem Cell Technologies | 60064 | Dilution: 1/200 |
| Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody | Miltenyi Biotec | 130-122-965 | Dilution: 1/50 |
| Bambanker™ (Cell freezing medium) | Nippon Genetics | BB01 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
| Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR | Greiner BIO-ONE | 665180 | |
| Countess™ II automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes) | Sued-Laborbedarf | 52 95-0213 | Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information. |
| CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) | Thermo Fisher Scientific | A16519 | |
| CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit) | Thermo Fisher Scientific | A16518 | |
| DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | 10236276001 | |
| DMEM High Glucose | TH.Geyer | L0102 | |
| DMEM/F12 w L-glutamine | Fisher Scientific | 15373541 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Dilution: 1/500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | Dilution: 1/500 |
| DPBS w/o Calcium w/o Magnesium | TH.Geyer | L0615-500 | |
| EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC) | Thermo Fisher Scientific | 710524 | Dilution: 1/500 |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Carl Roth | CN06.3 | |
| Falcon Tube 15 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 188271-N | |
| Falcon Tube 50 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| FlowJo V10.8.2 | FlowJo | 663441 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-1KG | |
| Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413301 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Heracell™ 240i CO2 incubator | Fisher Scientific | 16416639 | |
| Heraeus HeraSafe safety cabinet | Kendro | 51017905 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-749 | |
| ImageJ | Fiji | Version 2.9.0 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL | Nerbe Plus | 04-212-1000 | |
| Microscope Nikon eclipse TE2000-S | Nikon | TE2000-S | |
| Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody | R&D Systems | MAB1368 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody | R&D Systems | MAB1420 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-beta-III Tubulin antibody | R&D Systems | MAB1195 | Dilution: 1/100 |
| mTeSR™ 1 | STEMCELL Technolgies | 85850 | |
| Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4903S | Dilution: 1/400 |
| Normocure™ (Antimicrobial Reagent) | Invivogen | ant-noc | |
| Oct-4 Rabbit Antibody | Cell Signaling Technology | 2750S | Dilution: 1/400 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin. |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Recombinant Human PDGF-AB | PeproTech | 100-00AB | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SIGMA | 4-16KS | |
| Renal Epithelial Cell Basal Medium | ATCC | PCS-400-030 | |
| Renal Epithelial Cell Growth Kit | ATCC | PCS-400-040 | |
| Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900 | Cell Signaling Technology | 4900S | Dilution: 1/400 |
| SSEA4 (MC813) Mouse mAb | NEB | 4755S | Dilution: 1/500 |
| StemFit® Basic02 | Nippon Genetics | 3821.00 | The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12563011 | |
| Waterbath Precision GP 05 | Thermo Fisher Scientific | TSGP05 | |
| Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor) | Biozol | BYT-ORB153635 | |
| Antibody dilution buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Blocking buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| REMC medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Primary urine medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC culture medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC generation medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Urine wash buffer | For composition see the supplementary table S1 |
References
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