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생물학

尿由来の霊長類人工多能性幹細胞の作製と維持

Published: July 28, 2023
doi:
10.3791/64922
, , , ,
1Faculty of Biology,Ludwig Maximilian University of Munich, 2Institute for the Advanced Study of Human Biology,Kyoto University, 3Hakubi Center,Kyoto University

Summary

本プロトコルは、ヒトおよび非ヒト霊長類の尿由来細胞を人工多能性幹細胞(iPSC)に単離、増殖、および再プログラムする方法、ならびに新たに生成されたiPS細胞のフィーダーフリー維持のための指示書を記載している。

Abstract

霊長類多能性幹細胞とその誘導体を研究する種間アプローチは、疾患、発生、および進化の分子および細胞メカニズムをよりよく理解するために重要です。霊長類人工多能性幹細胞(iPSC)をより利用しやすくするために、本論文では、尿由来細胞からヒトおよび非ヒト霊長類iPS細胞を非侵襲的に生成する方法と、フィーダーフリー培養法によるそれらの維持について紹介する。

尿は、非滅菌環境(動物のケージなど)からサンプリングし、初代細胞培養中に広域抗生物質カクテルで処理して、汚染を効率的に減らすことができます。尿由来細胞の増殖後、市販のセンダイウイルスベクター系の改変形質導入法によりiPS細胞が生成される。最初のiPS細胞コロニーは、5日後にすでに見えている可能性があり、早くても10日後に摘み取ることができます。酵素フリー解離バッファーによるルーチンの凝集継代は、50回以上の継代で生成されたiPS細胞の多能性をサポートします。

Introduction

ヒト霊長類と非ヒト霊長類(NHP)のゲノム比較は、私たちの進化の歴史とヒト特異的形質の進化を理解するために重要です1。さらに、これらの比較は、保存されたDNA配列2を同定することによって、例えば、疾患関連変異体3に優先順位を付けることによって、機能の推論を可能にする。遺伝子発現レベルなどの分子表現型の比較は、ゲノム比較をより適切に解釈し、たとえば細胞表現型の違いを発見するために重要です。さらに、DNAレベルでの比較と同様に、機能的関連性を推測し、したがってヒト内の医学的に関連する変異をより適切に解釈する可能性があります4。これらの比較研究に包括的な分子表現型データを組み込むには、適切な生物学的資源(すなわち、種を超えたオーソログ細胞)が必要です。しかしながら、倫理的および実際的な理由により、特に発生中は、そのような同等の細胞にアクセスすることが困難または不可能である。人工多能性幹細胞(iPSC)は、インビトロでそのようなアクセスできない細胞型の生成を可能にし5、6、実験的にアクセス可能であり、霊長類の比較に使用されている6、7、8、9、10、11、12、13、14。

iPS細胞を作製するには、再プログラムする初代細胞を獲得する必要があります。尿から単離された細胞は、霊長類から非侵襲的にサンプリングでき、おそらく幹細胞のような分子プロファイルのために容易に再プログラムできるという利点があります15。霊長類のiPS細胞を維持するための培養条件は、リプログラミングと同じくらい重要です。古典的に、ヒト多能性幹細胞の培養には、未定義の血清ベースの培地と、胚性幹細胞(ESC)に必須栄養素と足場を提供するマウス胚性線維芽細胞(いわゆるフィーダー細胞)の共培養が必要でした16。化学的に定義されたフィーダーフリー培養システム17,18の開発以来、現在、市販のiPS細胞培養培地およびマトリックスには様々な選択肢がある。ただし、これらの培養条件のほとんどはヒトESCおよびiPS細胞用に最適化されているため、NHP iPS細胞培養ではあまりうまく機能しない可能性があります。このビデオプロトコルでは、尿路細胞培養由来のヒトおよびNHP iPS細胞を生成および維持するための手順を提供します。

2006年に線維芽細胞における定義因子の強制発現によるiPS細胞作製が初めて報告されて以来、本手法は様々な起源の様々な細胞型に適用されている19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 、32。このうち、尿由来の細胞のみが完全に非侵襲的に得ることができる。Zhouら33による前述のプロトコルに基づいて、広域抗生物質15を補充することにより、非滅菌サンプルからでも霊長類の尿から細胞を単離および増殖させることができます。特に、このプロトコルによってサンプリングされた尿由来細胞は、線維芽細胞の従来の再プログラミング(私たちの経験では20〜30日)よりも短い期間(コロニーが5〜15日で見えるようになる)でiPS細胞を産生する可能性が高いことを示し、十分に高い成功率を示します。これらの尿由来細胞は、間葉系幹細胞様細胞と膀胱上皮細胞の混合集団に分類され、高い初期化効率を生じさせた15。

初代細胞のばらつきに加えて、iPS細胞を生成するためのリプログラミング方法も使用目的によって異なります。ヒト体細胞に対する従来のリプログラミング手順は、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターによるリプログラミング因子の過剰発現によって行われ、これにより、ゲノム5,34,35への外因性DNAの組み込みが可能になりました。生成されたiPS細胞をゲノム的に無傷に保つために、研究者は多種多様な非組み込みシステムを開発しました-切除可能なPiggyBacベクター36,37、エピソームベクター38,39、センダイウイルス40やアデノウイルス41などの非組み込み型ウイルスベクター、mRNAトランスフェクション42、タンパク質トランスフェクション43,44、および化合物処理45.効率と取り扱いの容易さのために、センダイウイルスベースのリプログラミングベクターがこのプロトコルで使用されます。初代細胞の感染は、プレーティング前に5の感染多重度(MOI)で細胞およびウイルスの1時間の浮遊培養で行われる。この修正されたステップは、ウイルスが付着細胞培養物に直接添加される従来の方法と比較して、細胞表面とウイルスとの接触の可能性を高め、したがってより多くのiPS細胞コロニーをもたらす可能性がある15。

ヒトおよびNHP多能性幹細胞の継代は、凝集継代および単一細胞継代によって行うことができる。エチレンジアミン四酢酸(EDTA)は、カルシウムイオンとマグネシウムイオンを結合し、カドヘリンとインテグリンの付着活性を防ぐコスト効率の高いキレート剤です。EDTAは、接着分子が異なるため、未分化細胞が分化細胞より先に剥離するため、穏やかな選択的解離試薬としても使用されます。完全な解離は、プロテインキナーゼ(Rho/Rock)を介したミオシンの過活性化を含むRho/Rho関連コイルドコイルを介して霊長類iPS細胞の大量細胞死を誘導します。したがって、培養培地にRho/Rock阻害剤を補充することは、懸濁液中の単一細胞を必要とする実験に不可欠です46,47。このプロトコルでは、ルーチン継代法として凝集継代を推奨し、定義された細胞数の播種が必要な場合やサブクローニング中など、必要な場合にのみシングルセル継代を推奨します。

Protocol

この実験手順は、人体実験に関する責任ある倫理委員会(20-122、Ethikkommission LMU München)によって承認されました。すべての実験は、関連するガイドラインおよび規制に従って実施した。注:ヒトおよびNHPサンプルを扱う実験を開始する前に、適切な倫理委員会から承認を得る必要があります。すべての実験手順は、関連するガイドラインおよび規制に従って実行する必要があります。以下の?…

Representative Results

ヒトおよびNHP尿から細胞を単離する場合、単離直後に異なる種類の細胞を同定することができる。扁平上皮細胞、およびさまざまな小さな丸い細胞は、尿とともに排泄されます。女性の尿には、男性の尿よりもはるかに多くの扁平上皮細胞が含まれています(図1B-0日目; 補足図S1)。初代尿培地中での5日間の培養後、最初の接着増殖細胞が見られる(<strong class=…

Discussion

iPS細胞は、他の方法ではアクセスできない細胞型を in vitroで生成できるため、貴重な細胞型です。リプログラミングの出発物質として、例えば、線維芽細胞はすべての霊長類種から容易に入手できるわけではないが、本論文は尿由来細胞からiPS細胞を生成するためのプロトコルを提示する。これらの細胞は、非滅菌霊長類の尿サンプルからでも、広域スペクトルの抗生物質を培地に補?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作業は、DFG EN 1093 / 5-1(プロジェクト番号458247426)によってサポートされました。M.O.は日本学術振興会海外特別研究員の助成を受けました。すべての図は BioRender.com で作成されました。フローサイトメトリーは、ミュンヘン生物医学センターのコアファシリティフローサイトメトリーの助けを借りて実施されました。京都大学ASHBiの志田誠さんと武藤知世さん、映像撮影のサポートに感謝いたします。

Materials

Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution) Sigma-Aldrich SCR006
Amphotericin B-Solution Merck A2941-100ML
Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody  Stem Cell Technologies 60064 Dilution: 1/200
Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody  Miltenyi Biotec 130-122-965 Dilution: 1/50
Bambanker™ (Cell freezing medium) Nippon Genetics BB01
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3059-100G
Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR Greiner BIO-ONE 665180
Countess™ II automated cell counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes) Sued-Laborbedarf 52 95-0213 Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information.
CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) Thermo Fisher Scientific A16519
CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit) Thermo Fisher Scientific A16518
DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride Sigma-Aldrich 10236276001
DMEM High Glucose TH.Geyer L0102
DMEM/F12 w L-glutamine Fisher Scientific 15373541
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 Thermo Fisher Scientific A-21202 Dilution: 1/500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 Thermo Fisher Scientific A-21207 Dilution: 1/500
DPBS w/o Calcium w/o Magnesium TH.Geyer L0615-500
EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC) Thermo Fisher Scientific 710524 Dilution: 1/500
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Carl Roth CN06.3
Falcon Tube 15 mL conical bottom Greiner BIO-ONE 188271-N
Falcon Tube 50 mL conical bottom Greiner BIO-ONE 227261
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS) Thermo Fisher Scientific 10500064
FlowJo V10.8.2 FlowJo  663441
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich G1890-1KG
Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413301
GlutaMAX™ Supplement Thermo Fisher Scientific 35050038
Heracell™ 240i CO2 incubator Fisher Scientific 16416639
Heraeus HeraSafe safety cabinet Kendro 51017905
Human EGF, premium grade Miltenyi Biotec 130-097-749
ImageJ  Fiji Version 2.9.0
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Thermo Fisher Scientific 11140035
Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL Nerbe Plus 04-212-1000
Microscope Nikon eclipse TE2000-S Nikon TE2000-S
Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody R&D Systems MAB1368 Dilution: 1/100
Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody R&D Systems MAB1420 Dilution: 1/100
Mouse anti-beta-III Tubulin antibody R&D Systems MAB1195 Dilution: 1/100
mTeSR™ 1 STEMCELL Technolgies 85850
Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb  Cell Signaling Technology 4903S Dilution: 1/400
Normocure™ (Antimicrobial Reagent) Invivogen ant-noc
Oct-4 Rabbit Antibody  Cell Signaling Technology 2750S Dilution: 1/400
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 441244-1KG
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS) Thermo Fisher Scientific 15140122 Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin.
Recombinant Human FGF-basic PeproTech 100-18B
Recombinant Human PDGF-AB PeproTech 100-00AB
Refrigerated benchtop centrifuge SIGMA  4-16KS
Renal Epithelial Cell Basal Medium ATCC PCS-400-030
Renal Epithelial Cell Growth Kit ATCC PCS-400-040
Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900 Cell Signaling Technology 4900S Dilution: 1/400
SSEA4 (MC813) Mouse mAb NEB 4755S Dilution: 1/500
StemFit® Basic02 Nippon Genetics 3821.00 The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead.
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787-50ML
TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme) Thermo Fisher Scientific 12563011
Waterbath Precision GP 05 Thermo Fisher Scientific TSGP05
Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor) Biozol BYT-ORB153635
Antibody dilution buffer For composition see the supplementary table S1
Blocking buffer For composition see the supplementary table S1
REMC medium For composition see the supplementary table S1
Primary urine medium For composition see the supplementary table S1
PSC culture medium For composition see the supplementary table S1
PSC generation medium For composition see the supplementary table S1
Urine wash buffer For composition see the supplementary table S1
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References

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Radmer, J., Geuder, J., Edenhofer, F. C., Enard, W., Ohnuki, M. Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine. J. Vis. Exp. (197), e64922, doi:10.3791/64922 (2023).
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