本プロトコルは、ヒトおよび非ヒト霊長類の尿由来細胞を人工多能性幹細胞(iPSC)に単離、増殖、および再プログラムする方法、ならびに新たに生成されたiPS細胞のフィーダーフリー維持のための指示書を記載している。
霊長類多能性幹細胞とその誘導体を研究する種間アプローチは、疾患、発生、および進化の分子および細胞メカニズムをよりよく理解するために重要です。霊長類人工多能性幹細胞(iPSC)をより利用しやすくするために、本論文では、尿由来細胞からヒトおよび非ヒト霊長類iPS細胞を非侵襲的に生成する方法と、フィーダーフリー培養法によるそれらの維持について紹介する。
尿は、非滅菌環境(動物のケージなど)からサンプリングし、初代細胞培養中に広域抗生物質カクテルで処理して、汚染を効率的に減らすことができます。尿由来細胞の増殖後、市販のセンダイウイルスベクター系の改変形質導入法によりiPS細胞が生成される。最初のiPS細胞コロニーは、5日後にすでに見えている可能性があり、早くても10日後に摘み取ることができます。酵素フリー解離バッファーによるルーチンの凝集継代は、50回以上の継代で生成されたiPS細胞の多能性をサポートします。
ヒト霊長類と非ヒト霊長類(NHP)のゲノム比較は、私たちの進化の歴史とヒト特異的形質の進化を理解するために重要です1。さらに、これらの比較は、保存されたDNA配列2を同定することによって、例えば、疾患関連変異体3に優先順位を付けることによって、機能の推論を可能にする。遺伝子発現レベルなどの分子表現型の比較は、ゲノム比較をより適切に解釈し、たとえば細胞表現型の違いを発見するために重要です。さらに、DNAレベルでの比較と同様に、機能的関連性を推測し、したがってヒト内の医学的に関連する変異をより適切に解釈する可能性があります4。これらの比較研究に包括的な分子表現型データを組み込むには、適切な生物学的資源(すなわち、種を超えたオーソログ細胞)が必要です。しかしながら、倫理的および実際的な理由により、特に発生中は、そのような同等の細胞にアクセスすることが困難または不可能である。人工多能性幹細胞(iPSC)は、インビトロでそのようなアクセスできない細胞型の生成を可能にし5、6、実験的にアクセス可能であり、霊長類の比較に使用されている6、7、8、9、10、11、12、13、14。
iPS細胞を作製するには、再プログラムする初代細胞を獲得する必要があります。尿から単離された細胞は、霊長類から非侵襲的にサンプリングでき、おそらく幹細胞のような分子プロファイルのために容易に再プログラムできるという利点があります15。霊長類のiPS細胞を維持するための培養条件は、リプログラミングと同じくらい重要です。古典的に、ヒト多能性幹細胞の培養には、未定義の血清ベースの培地と、胚性幹細胞(ESC)に必須栄養素と足場を提供するマウス胚性線維芽細胞(いわゆるフィーダー細胞)の共培養が必要でした16。化学的に定義されたフィーダーフリー培養システム17,18の開発以来、現在、市販のiPS細胞培養培地およびマトリックスには様々な選択肢がある。ただし、これらの培養条件のほとんどはヒトESCおよびiPS細胞用に最適化されているため、NHP iPS細胞培養ではあまりうまく機能しない可能性があります。このビデオプロトコルでは、尿路細胞培養由来のヒトおよびNHP iPS細胞を生成および維持するための手順を提供します。
2006年に線維芽細胞における定義因子の強制発現によるiPS細胞作製が初めて報告されて以来、本手法は様々な起源の様々な細胞型に適用されている19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 、32。このうち、尿由来の細胞のみが完全に非侵襲的に得ることができる。Zhouら33による前述のプロトコルに基づいて、広域抗生物質15を補充することにより、非滅菌サンプルからでも霊長類の尿から細胞を単離および増殖させることができます。特に、このプロトコルによってサンプリングされた尿由来細胞は、線維芽細胞の従来の再プログラミング(私たちの経験では20〜30日)よりも短い期間(コロニーが5〜15日で見えるようになる)でiPS細胞を産生する可能性が高いことを示し、十分に高い成功率を示します。これらの尿由来細胞は、間葉系幹細胞様細胞と膀胱上皮細胞の混合集団に分類され、高い初期化効率を生じさせた15。
初代細胞のばらつきに加えて、iPS細胞を生成するためのリプログラミング方法も使用目的によって異なります。ヒト体細胞に対する従来のリプログラミング手順は、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターによるリプログラミング因子の過剰発現によって行われ、これにより、ゲノム5,34,35への外因性DNAの組み込みが可能になりました。生成されたiPS細胞をゲノム的に無傷に保つために、研究者は多種多様な非組み込みシステムを開発しました-切除可能なPiggyBacベクター36,37、エピソームベクター38,39、センダイウイルス40やアデノウイルス41などの非組み込み型ウイルスベクター、mRNAトランスフェクション42、タンパク質トランスフェクション43,44、および化合物処理45.効率と取り扱いの容易さのために、センダイウイルスベースのリプログラミングベクターがこのプロトコルで使用されます。初代細胞の感染は、プレーティング前に5の感染多重度(MOI)で細胞およびウイルスの1時間の浮遊培養で行われる。この修正されたステップは、ウイルスが付着細胞培養物に直接添加される従来の方法と比較して、細胞表面とウイルスとの接触の可能性を高め、したがってより多くのiPS細胞コロニーをもたらす可能性がある15。
ヒトおよびNHP多能性幹細胞の継代は、凝集継代および単一細胞継代によって行うことができる。エチレンジアミン四酢酸(EDTA)は、カルシウムイオンとマグネシウムイオンを結合し、カドヘリンとインテグリンの付着活性を防ぐコスト効率の高いキレート剤です。EDTAは、接着分子が異なるため、未分化細胞が分化細胞より先に剥離するため、穏やかな選択的解離試薬としても使用されます。完全な解離は、プロテインキナーゼ(Rho/Rock)を介したミオシンの過活性化を含むRho/Rho関連コイルドコイルを介して霊長類iPS細胞の大量細胞死を誘導します。したがって、培養培地にRho/Rock阻害剤を補充することは、懸濁液中の単一細胞を必要とする実験に不可欠です46,47。このプロトコルでは、ルーチン継代法として凝集継代を推奨し、定義された細胞数の播種が必要な場合やサブクローニング中など、必要な場合にのみシングルセル継代を推奨します。
iPS細胞は、他の方法ではアクセスできない細胞型を in vitroで生成できるため、貴重な細胞型です。リプログラミングの出発物質として、例えば、線維芽細胞はすべての霊長類種から容易に入手できるわけではないが、本論文は尿由来細胞からiPS細胞を生成するためのプロトコルを提示する。これらの細胞は、非滅菌霊長類の尿サンプルからでも、広域スペクトルの抗生物質を培地に補?…
The authors have nothing to disclose.
この作業は、DFG EN 1093 / 5-1(プロジェクト番号458247426)によってサポートされました。M.O.は日本学術振興会海外特別研究員の助成を受けました。すべての図は BioRender.com で作成されました。フローサイトメトリーは、ミュンヘン生物医学センターのコアファシリティフローサイトメトリーの助けを借りて実施されました。京都大学ASHBiの志田誠さんと武藤知世さん、映像撮影のサポートに感謝いたします。
Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution) | Sigma-Aldrich | SCR006 | |
Amphotericin B-Solution | Merck | A2941-100ML | |
Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody | Stem Cell Technologies | 60064 | Dilution: 1/200 |
Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody | Miltenyi Biotec | 130-122-965 | Dilution: 1/50 |
Bambanker™ (Cell freezing medium) | Nippon Genetics | BB01 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR | Greiner BIO-ONE | 665180 | |
Countess™ II automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes) | Sued-Laborbedarf | 52 95-0213 | Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information. |
CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) | Thermo Fisher Scientific | A16519 | |
CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit) | Thermo Fisher Scientific | A16518 | |
DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | 10236276001 | |
DMEM High Glucose | TH.Geyer | L0102 | |
DMEM/F12 w L-glutamine | Fisher Scientific | 15373541 | |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Dilution: 1/500 |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | Dilution: 1/500 |
DPBS w/o Calcium w/o Magnesium | TH.Geyer | L0615-500 | |
EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC) | Thermo Fisher Scientific | 710524 | Dilution: 1/500 |
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Carl Roth | CN06.3 | |
Falcon Tube 15 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 188271-N | |
Falcon Tube 50 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 227261 | |
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
FlowJo V10.8.2 | FlowJo | 663441 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-1KG | |
Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413301 | |
GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
Heracell™ 240i CO2 incubator | Fisher Scientific | 16416639 | |
Heraeus HeraSafe safety cabinet | Kendro | 51017905 | |
Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-749 | |
ImageJ | Fiji | Version 2.9.0 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL | Nerbe Plus | 04-212-1000 | |
Microscope Nikon eclipse TE2000-S | Nikon | TE2000-S | |
Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody | R&D Systems | MAB1368 | Dilution: 1/100 |
Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody | R&D Systems | MAB1420 | Dilution: 1/100 |
Mouse anti-beta-III Tubulin antibody | R&D Systems | MAB1195 | Dilution: 1/100 |
mTeSR™ 1 | STEMCELL Technolgies | 85850 | |
Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4903S | Dilution: 1/400 |
Normocure™ (Antimicrobial Reagent) | Invivogen | ant-noc | |
Oct-4 Rabbit Antibody | Cell Signaling Technology | 2750S | Dilution: 1/400 |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin. |
Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
Recombinant Human PDGF-AB | PeproTech | 100-00AB | |
Refrigerated benchtop centrifuge | SIGMA | 4-16KS | |
Renal Epithelial Cell Basal Medium | ATCC | PCS-400-030 | |
Renal Epithelial Cell Growth Kit | ATCC | PCS-400-040 | |
Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900 | Cell Signaling Technology | 4900S | Dilution: 1/400 |
SSEA4 (MC813) Mouse mAb | NEB | 4755S | Dilution: 1/500 |
StemFit® Basic02 | Nippon Genetics | 3821.00 | The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12563011 | |
Waterbath Precision GP 05 | Thermo Fisher Scientific | TSGP05 | |
Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor) | Biozol | BYT-ORB153635 | |
Antibody dilution buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
Blocking buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
REMC medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
Primary urine medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
PSC culture medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
PSC generation medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
Urine wash buffer | For composition see the supplementary table S1 |