O presente protocolo descreve um método para isolar, expandir e reprogramar células derivadas da urina de primatas humanos e não humanos para células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), bem como instruções para a manutenção livre de alimentadores das iPSCs recém-geradas.
Abordagens entre espécies que estudam células-tronco pluripotentes de primatas e seus derivados são cruciais para entender melhor os mecanismos moleculares e celulares de doenças, desenvolvimento e evolução. Para tornar as células-tronco pluripotentes induzidas por primatas (iPSCs) mais acessíveis, este artigo apresenta um método não invasivo para gerar iPSCs de primatas humanos e não humanos a partir de células derivadas da urina, e sua manutenção usando um método de cultura livre de alimentadores.
A urina pode ser coletada de um ambiente não estéril (por exemplo, a gaiola do animal) e tratada com um coquetel antibiótico de amplo espectro durante a cultura de células primárias para reduzir a contaminação de forma eficiente. Após a propagação das células derivadas da urina, as iPSCs são geradas por um método de transdução modificado de um sistema vetorial do vírus Sendai comercialmente disponível. As primeiras colônias de iPSC podem já estar visíveis após 5 dias, e podem ser colhidas após 10 dias, no mínimo. A passagem de rotina de aglomerados com tampão de dissociação livre de enzimas suporta a pluripotência das iPSCs geradas por mais de 50 passagens.
Comparações genômicas de primatas humanos e não humanos (NHPs) são cruciais para entender nossa história evolutiva e a evolução de características específicas do ser humano1. Além disso, essas comparações permitem inferir a função identificando sequências conservadas de DNA2, por exemplo, para priorizar variantes associadas à doença3. Comparações de fenótipos moleculares, como níveis de expressão gênica, são cruciais para melhor interpretar comparações genômicas e descobrir, por exemplo, diferenças fenotípicas celulares. Além disso, eles têm – semelhante a comparações no nível do DNA – o potencial de inferir relevância funcional e, portanto, interpretar melhor a variação clinicamente relevante em humanos4. A incorporação de dados fenotípicos moleculares abrangentes nesses estudos comparativos requer recursos biológicos apropriados (isto é, células ortológicas entre espécies). No entanto, razões éticas e práticas dificultam ou impossibilitam o acesso a essas células comparáveis, especialmente durante o desenvolvimento. As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) permitem a geração desses tipos celulares inacessíveis in vitro5,6, são experimentalmente acessíveis e têm sido utilizadas para comparações de primatas 6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Para gerar iPSCs, é preciso adquirir as células primárias a serem reprogramadas. As células isoladas da urina têm a vantagem de poderem ser amostradas de primatas de forma não invasiva e de poderem ser prontamente reprogramadas, provavelmente devido ao seu perfil molecular semelhante ao das células-tronco15. As condições de cultura para manter as iPSCs de primatas são tão importantes quanto a reprogramação; classicamente, a cultura de células-tronco pluripotentes humanas requer um meio não definido, baseado em soro, e co-cultura de fibroblastos embrionários de camundongos – as chamadas células alimentadoras – que fornecem nutrientes essenciais e um arcabouço para células-tronco embrionárias (CTEs)16. Desde o desenvolvimento de sistemas de cultura quimicamente definidos e livres de alimentadores17,18, existem atualmente várias opções de meios e matrizes de cultura iPSC comercialmente disponíveis. No entanto, a maioria dessas condições de cultura foi otimizada para CTEs e iPSCs humanas e, portanto, pode funcionar menos bem na cultura iPSC NHP. Neste protocolo de vídeo, fornecemos instruções para gerar e manter iPSCs humanas e NHP derivadas de cultura de células urinárias.
Desde o primeiro relato de geração de iPSC pela expressão forçada de fatores definidos em fibroblastos, em 2006, esse método tem sido aplicado a diversos tipos celulares de diversas origens19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32º. Entre elas, apenas células derivadas da urina podem ser obtidas de forma completamente não invasiva. Com base no protocolo previamente descrito por Zhou et al.33, pode-se isolar e expandir células da urina de primatas mesmo de amostras não estéreis, suplementando antibióticos de amplo espectro15. Notavelmente, as células derivadas da urina amostradas por este protocolo exibem um alto potencial para produzir iPSCs, dentro de um período de tempo mais curto (colônias tornam-se visíveis em 5-15 dias) do que a reprogramação convencional de fibroblastos (20-30 dias, em nossa experiência), e com uma taxa de sucesso suficientemente alta. Essas células derivadas da urina foram classificadas como a população mista de células-tronco mesenquimais e células epiteliais da bexiga, causando a alta eficiência da reprogramação15.
Além da variação nas células primárias, os métodos de reprogramação para gerar iPSCs também variam de acordo com a finalidade de uso. Os procedimentos convencionais de reprogramação de células somáticas humanas foram realizados pela superexpressão de fatores de reprogramação com vetores de retrovírus ou lentivírus, o que permitiu a integração do DNA exógeno no genoma 5,34,35. Para manter as iPSCs geradas genomicamente intactas, os pesquisadores desenvolveram uma ampla variedade de sistemas de não-integração – vetor PiggyBac excisável36,37, vetor epissomal38,39, vetores virais não integradores como o vírus Sendai 40 e adenovírus 41, transfecção de RNAm42, transfecção de proteínas 43,44 e tratamento de compostos químicos 45. Devido à eficiência e facilidade no manuseio, os vetores de reprogramação baseados no vírus de Sendai são utilizados neste protocolo. A infecção de células primárias é realizada em uma cultura de suspensão de 1 h de células e vírus em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5 antes do plaqueamento. Essa etapa modificada poderia aumentar a probabilidade de contato entre superfícies celulares e vírus, em comparação com o método convencional, no qual os vírus são adicionados diretamente à cultura de células aderentes e, assim, produzir mais colônias de iPSC15.
A passagem de células-tronco pluripotentes humanas e NHP pode ser feita por passagem de aglomeração e passagem de célula única. O ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) é um agente quelante de baixo custo que se liga aos íons cálcio e magnésio e, assim, impede a atividade aderente da caderina e da integrina. O EDTA também é usado como um reagente de dissociação leve e seletivo, pois as células indiferenciadas se desprendem antes das células diferenciadas devido às suas diferentes moléculas de adesão. A dissociação completa induz a morte celular maciça de iPSCs de primatas através da hiperativação da miosina mediada pela proteína quinase (Rho/Rock) associada à bobina Rho/Rho. Portanto, a suplementação do meio de cultura com um inibidor de Rho/Rock é essencial para experimentos que necessitem de células isoladas em suspensão46,47. Neste protocolo, recomendamos a passagem de aglomeração como o método de passagem de rotina e recomendamos a passagem de célula única apenas quando for necessário, por exemplo, quando a semeadura de números de células definidos for necessária, ou durante a subclonagem.
As iPSCs são tipos celulares valiosos, pois permitem a geração de tipos celulares inacessíveis in vitro. Como os materiais de partida para a reprogramação, por exemplo, fibroblastos não estão facilmente disponíveis em todas as espécies de primatas, este trabalho apresenta um protocolo para a geração de iPSCs a partir de células derivadas da urina. Essas células podem ser obtidas de forma não invasiva, mesmo a partir de amostras não estéreis de urina de primatas, suplementando-se o meio de cultur…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pela DFG EN 1093/5-1 (projeto número 458247426). M.O. foi apoiado pela JSPS Overseas Research Fellowship. Todas as figuras foram criadas com BioRender.com. A citometria de fluxo foi realizada com o auxílio da citometria de fluxo do Core Facility no Biomedical Center Munich. Gostaríamos de agradecer a Makoto Shida e Tomoyo Muto da ASHBi, Universidade de Kyoto, pelo apoio à videografia.
Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution) | Sigma-Aldrich | SCR006 | |
Amphotericin B-Solution | Merck | A2941-100ML | |
Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody | Stem Cell Technologies | 60064 | Dilution: 1/200 |
Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody | Miltenyi Biotec | 130-122-965 | Dilution: 1/50 |
Bambanker™ (Cell freezing medium) | Nippon Genetics | BB01 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR | Greiner BIO-ONE | 665180 | |
Countess™ II automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes) | Sued-Laborbedarf | 52 95-0213 | Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information. |
CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) | Thermo Fisher Scientific | A16519 | |
CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit) | Thermo Fisher Scientific | A16518 | |
DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | 10236276001 | |
DMEM High Glucose | TH.Geyer | L0102 | |
DMEM/F12 w L-glutamine | Fisher Scientific | 15373541 | |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Dilution: 1/500 |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | Dilution: 1/500 |
DPBS w/o Calcium w/o Magnesium | TH.Geyer | L0615-500 | |
EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC) | Thermo Fisher Scientific | 710524 | Dilution: 1/500 |
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Carl Roth | CN06.3 | |
Falcon Tube 15 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 188271-N | |
Falcon Tube 50 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 227261 | |
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
FlowJo V10.8.2 | FlowJo | 663441 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-1KG | |
Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413301 | |
GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
Heracell™ 240i CO2 incubator | Fisher Scientific | 16416639 | |
Heraeus HeraSafe safety cabinet | Kendro | 51017905 | |
Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-749 | |
ImageJ | Fiji | Version 2.9.0 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL | Nerbe Plus | 04-212-1000 | |
Microscope Nikon eclipse TE2000-S | Nikon | TE2000-S | |
Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody | R&D Systems | MAB1368 | Dilution: 1/100 |
Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody | R&D Systems | MAB1420 | Dilution: 1/100 |
Mouse anti-beta-III Tubulin antibody | R&D Systems | MAB1195 | Dilution: 1/100 |
mTeSR™ 1 | STEMCELL Technolgies | 85850 | |
Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4903S | Dilution: 1/400 |
Normocure™ (Antimicrobial Reagent) | Invivogen | ant-noc | |
Oct-4 Rabbit Antibody | Cell Signaling Technology | 2750S | Dilution: 1/400 |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin. |
Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
Recombinant Human PDGF-AB | PeproTech | 100-00AB | |
Refrigerated benchtop centrifuge | SIGMA | 4-16KS | |
Renal Epithelial Cell Basal Medium | ATCC | PCS-400-030 | |
Renal Epithelial Cell Growth Kit | ATCC | PCS-400-040 | |
Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900 | Cell Signaling Technology | 4900S | Dilution: 1/400 |
SSEA4 (MC813) Mouse mAb | NEB | 4755S | Dilution: 1/500 |
StemFit® Basic02 | Nippon Genetics | 3821.00 | The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12563011 | |
Waterbath Precision GP 05 | Thermo Fisher Scientific | TSGP05 | |
Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor) | Biozol | BYT-ORB153635 | |
Antibody dilution buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
Blocking buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
REMC medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
Primary urine medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
PSC culture medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
PSC generation medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
Urine wash buffer | For composition see the supplementary table S1 |