Un protocollo per valutare e quantificare le patologie dell'epitelio pigmentato retinico in modelli murini di degenerazione maculare legata all'età

Summary

I modelli murini possono essere strumenti utili per studiare la biologia dell’epitelio pigmentato retinico (RPE). È stato stabilito che i topi possono sviluppare una serie di patologie RPE. Qui, descriviamo un protocollo di fenotipizzazione per chiarire e quantificare le patologie RPE nei topi utilizzando luce, elettrone di trasmissione e microscopia confocale.

Abstract

La degenerazione maculare legata all’età (AMD) è una malattia debilitante della retina nelle popolazioni che invecchiano. È opinione diffusa che la disfunzione dell’epitelio pigmentato retinico (RPE) sia un evento patobiologico chiave nell’AMD. Per comprendere i meccanismi che portano alla disfunzione RPE, i modelli murini possono essere utilizzati dai ricercatori. È stato stabilito da studi precedenti che i topi possono sviluppare patologie RPE, alcune delle quali sono osservate negli occhi di individui con diagnosi di AMD. Qui, descriviamo un protocollo di fenotipizzazione per valutare le patologie RPE nei topi. Questo protocollo include la preparazione e la valutazione delle sezioni trasversali retiniche mediante microscopia ottica e microscopia elettronica a trasmissione, nonché quella dei supporti piani RPE mediante microscopia confocale. Descriviamo in dettaglio i tipi comuni di patologie RPE murine osservate da queste tecniche e i modi per quantificarle attraverso metodi imparziali per i test statistici. Come prova del concetto, utilizziamo questo protocollo di fenotipizzazione RPE per quantificare le patologie RPE osservate nei topi che sovraesprimono la proteina transmembrana 135 (Tmem135) e nei topi C57BL/6J wild-type invecchiati. L’obiettivo principale di questo protocollo è quello di presentare metodi standard di fenotipizzazione RPE con valutazioni quantitative imparziali per gli scienziati che utilizzano modelli murini di AMD.

Introduction

La degenerazione maculare legata all’età (AMD) è una malattia accecante comune che colpisce le popolazioni di età superiore ai 55^{anni 1}. Molti ricercatori ritengono che la disfunzione all’interno dell’epitelio pigmentato retinico (RPE) sia un evento patobiologico precoce e cruciale nell’AMD². L’RPE è un monostrato di cellule polarizzate che ha il compito di mantenere l’omeostasi dei fotorecettori vicini e dei vasi sanguigni coroideali³. Esistono vari modelli per studiare i meccanismi associati alla malattia all’interno dell’RPE, compresi i modelli di coltura cellulare ^4,5 e topi 6,7,8. Un recente rapporto ha descritto protocolli standardizzati e criteri di controllo della qualità per i modelli di coltura cellulare RPE⁴, ma nessun rapporto ha tentato di standardizzare la fenotipizzazione dell’RPE nei modelli murini. In effetti, molte pubblicazioni su modelli murini di AMD mancano di una descrizione completa dell’RPE o della quantificazione delle patologie RPE in essi. L’obiettivo generale di questo protocollo è quello di presentare metodi standard di fenotipizzazione RPE con valutazioni quantitative imparziali per gli scienziati che utilizzano modelli murini AMD.

Pubblicazioni precedenti hanno notato la presenza di diverse patologie RPE nei topi attraverso tre tecniche di imaging. Ad esempio, la microscopia ottica consente ai ricercatori di visualizzare la morfologia grossolana della retina murina (Figura 1A) e rilevare patologie RPE come assottigliamento RPE, vacuolizzazione e migrazione. L’assottigliamento dell’RPE in un modello di mouse AMD è esemplificato da una deviazione nell’altezza dell’RPE dai rispettivi controlli (Figura 1B). La vacuolizzazione RPE può essere suddivisa in due categorie separate: microvacuolizzazione (Figura 1C) e macrovacuolizzazione (Figura 1D). La microvacuolizzazione RPE è riassunta dalla presenza di vacuoli nell’RPE che non influiscono sulla sua altezza complessiva, mentre la macrovacuolizzazione è indicata dalla presenza di vacuoli che sporgono nei segmenti esterni dei fotorecettori. La migrazione RPE si distingue per l’aggregato focale di pigmento sopra il monostrato RPE in una sezione trasversale retinica (Figura 1E). Va notato che le cellule RPE migratorie negli occhi dei donatori di AMD mostrano immunoreattività ai marcatori delle cellule immunitarie, come il cluster di differenziazione 68 (CD68)9, e potrebbero rappresentare cellule immunitarie che inghiottono detriti RPE o RPE in fase di transdifferenziazione ⁹. Un’altra tecnica di imaging chiamata microscopia elettronica a trasmissione può consentire ai ricercatori di visualizzare l’ultrastruttura dell’RPE e la sua membrana basale (Figura 2A). Questa tecnica può identificare il deposito sub-RPE predominante nei topi, noto come deposito laminare basale (BLamD) (Figura 2B)¹⁰. Infine, la microscopia confocale può rivelare la struttura delle cellule RPE attraverso l’imaging di supporti piatti RPE (Figura 3A). Questo metodo può scoprire la dismorfia RPE, la deviazione dell’RPE dalla sua classica forma a nido d’ape (Figura 3B). Può anche rilevare la multinucleazione RPE, la presenza di tre o più nuclei all’interno di una cellula RPE (Figura 3C). Per una sintesi dei tipi di patologie RPE presenti negli attuali modelli murini AMD, rimandiamo i ricercatori a queste recensioni dalla letteratura ^6,7.

I ricercatori che studiano l’AMD dovrebbero essere consapevoli dei vantaggi e degli svantaggi dell’uso dei topi per studiare le patologie RPE prima del protocollo di fenotipizzazione. I topi sono vantaggiosi a causa della loro durata di vita relativamente breve e del rapporto costo-efficacia, nonché della loro manipolabilità genetica e farmacologica. I topi mostrano anche cambiamenti degenerativi RPE, tra cui migrazione RPE, dismorfia e multinucleazione, che si osservano negli occhi dei donatori di AMD 11,12,13,14,15,16,17; ciò suggerisce che meccanismi simili possono essere alla base dello sviluppo di queste patologie RPE nei topi e negli esseri umani. Tuttavia, ci sono differenze chiave che limitano la traducibilità degli studi sui topi all’AMD umana. In primo luogo, i topi non hanno una macula, una regione anatomicamente distinta della retina umana necessaria per l’acuità visiva che è preferenzialmente influenzata nell’AMD. In secondo luogo, alcune patologie RPE nei topi, come l’assottigliamento e la vacuolizzazione dell’RPE, non sono tipicamente osservate negli occhi dei donatori di AMD¹⁸. In terzo luogo, i topi non sviluppano drusen, un segno distintivo della patologia AMD¹⁹. Le drusen sono depositi contenenti lipidi e proteine con pochissime proteine di membrana basale che si formano tra la lamina basale RPE e lo strato collagenoso interno della membrana di Bruch (BrM)¹⁹. Drusen differisce da BLamD, il comune deposito sub-RPE nei topi, sia nella loro composizione che nella posizione anatomica. Le BLamD sono anomalie arricchite dalla matrice extracellulare dipendenti dall’età e dallo stress che si formano tra la lamina basale RPE di BrM e le pieghe basali dell’RPE²⁰. È interessante notare che i BLamD hanno una composizione proteica e un aspetto simili sia nei topi che negli esseri umani ^6,10,21. Lavori recenti suggeriscono che i BLamD possono agire nella patobiologia dell’AMD influenzando la progressione dell’AMD fino alle sue fasi successive^18,22; pertanto, questi depositi possono rappresentare RPE malato nella retina del topo. La conoscenza di questi benefici e limitazioni è fondamentale per i ricercatori interessati a tradurre i risultati degli studi sui topi in AMD.

In questo protocollo, discutiamo i metodi per preparare gli occhi alla luce, alla trasmissione elettronica e alla microscopia confocale per visualizzare le patologie RPE. Descriviamo anche come quantificare le patologie RPE in modo imparziale per i test statistici. Come prova del concetto, utilizziamo il protocollo di fenotipizzazione RPE per studiare le patologie strutturali RPE osservate nei topi sovraesprimenti della proteina transmembrana 135- (Tmem135) e nei topi C57BL / 6J wild-type (WT) invecchiati. In sintesi, ci proponiamo di descrivere la metodologia di fenotipizzazione per caratterizzare l’RPE nei modelli murini AMD, poiché attualmente non sono disponibili protocolli standard. I ricercatori interessati a esaminare e quantificare le patologie dei fotorecettori o della coroide, che sono anche interessati nei modelli murini AMD, potrebbero non trovare questo protocollo utile per i loro studi.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dall’Institutional Animal Care and Use Committee presso l’Università del Wisconsin-Madison e sono in aderenza con la dichiarazione dell’Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l’uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva. 1. Valutazione dell’RPE del mouse mediante microscopia ottica Fare un tampone fissativo che abbia una concentrazione finale del 2% di paraformald…

Representative Results

Il completamento del protocollo di fenotipizzazione RPE descritto in questo articolo fornisce un’analisi quantitativa delle anomalie strutturali di RPE comunemente osservate nei modelli murini di AMD. Per confermare l’efficacia di questo protocollo, lo abbiamo usato in topi noti per mostrare patologie RPE, inclusi topi transgenici che sovraesprimono WT Tmem135 guidato dal promotore della beta-actina di pollo (Tmem135 TG) 30 e topi C57BL / 6J invecchiati 31,32<sup class…

Discussion

In questo articolo, abbiamo introdotto un protocollo di fenotipizzazione per valutare le patologie RPE strutturali dei modelli murini. Abbiamo descritto i passaggi necessari per l’elaborazione degli occhi per varie tecniche di imaging tra cui luce, elettrone di trasmissione e microscopia confocale, nonché la quantificazione delle patologie tipiche osservate tramite questi metodi di imaging. Abbiamo dimostrato l’efficacia del nostro protocollo di fenotipizzazione RPE esaminando Tmem135 TG e topi WT di 2…

Materials

0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2	PolyScientiifc R&D Company	S1619
100 Capacity Slide Box			Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.)
100% Ethanol	MDS Warehouse	2292-CASE	Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks	Qosina	11069
1x Phosphate Buffer Solution (PBS)			Premade 1x PBS can be used in this protocol.
2.0 mL microtubes	Genesee Scientific	24-283-LR
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold	Electron Microscopy Sciences	70165
24 inch PVC Tubing with Luer Ends	Fisher Scientific	NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids	Electron Microscopy Sciences	T400-Cu
95% Ethanol	MDS Warehouse	2293-CASE
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches)	VWR	56616-031
Adjustable 237 ml  Spray Bottle	VWR	23609-182
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Aluminum Foil
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle	Sigma-Aldrich	Z192546
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width	Roboz Surgical Instrument	RS-5211	Known as curved forceps in this protocol.
Camel Hair Brush	Electron Microscopy Sciences	65575-02
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber
Carbon Dioxide Flow Meter
Carbon Dioxide Tank
Castaloy Prong Extension Clamps	Fisher Scientific	05-769-7Q
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand	Fisher Scientific	11-474-207
Cell Prolifer Program			Available to download: https://cellprofiler.org/releases
Clear Nail Polish	Electron Microscopy Sciences	72180
Colorfrost Microscope Slides Lavender	VWR	10118-956
Computer
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-5MG
Distilled H20			Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55	Roboz Surgical Instrument	RS-4984	Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).
Electron Microscopy Grid Holder	Electron Microscopy Sciences	71147-01
EPON 815 Resin	Electron Microscopy Sciences	14910
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye	Fisher Scientific	22050460	Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye.
Epredia Mounting Media	Fisher Scientific	22-110-610	Use for mounting H&E slides.
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source	Dolan-Jenner Industries	Mi-150	Light source for dissecting microscope.
Fiji ImageJ Program			Available to download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector	Thermo Scientific	14-666-18Q
Fume hood
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32%	Electron Microscopy Sciences	16537-05
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera
Laboratory Benchtop Shaker			Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.
Laser Cryo Tag Labels	Electron Microscopy Sciences	77564-05
Lead Citrate	Electron Microscopy Sciences	17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips	Thermo Fisher Scientific	22X22I24788001LS	Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.
Mayer's Hematoxylin	VWR	100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz Surgical Instrument	RS-5600	Known as micro-dissecting scissors in protocol.
Methanol	Fisher Scientific	A412-4
Mice			Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length	Roboz Surgical Instrument	RS-5913	Known as curved scissors in this protocol.
Microsoft Excel
Microtube racks
Nikon A1RS Confocal Microscope
Normal Donkey Serum	SouthernBiotech	0030-01
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades	VWR	21909-380
Osmium Tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19150
Paraformaldehyde, 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Pencil
Petri Dish	VWR	21909-380
Pipette Tips
Pipettes
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody	Thermo Fisher Scientific	402200
Propylene Oxide	Electron Microscopy Sciences	20412
Razor Blade	VWR	10040-386
Shallow Tray for Mouse Perfusions
Shandon Eosin Y Alcoholic	VWR	89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker	Staples	642736
Slide Rack for Staining	Grainger	49WF31
Squared Cover Glass Slips	Fisher Scientific	12-541B
Staining Dish with Cover	Grainger	49WF30	Need 15 for H&E staining procedure.
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe	Thermo Scientific	S7510-50	Use only the syringe barrel.
Timer	Fisher	1464917
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Vacuum Oven
Vectashield Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Use for mounting RPE flat mounts.
Xylene	Fisher Scientific	22050283
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope			This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching.
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope	Electron Microscopy Sciences	65575-02