Протокол оценки и количественной оценки патологий пигментного эпителия сетчатки на мышиных моделях возрастной макулярной дегенерации

Summary

Мышиные модели могут быть полезными инструментами для исследования биологии пигментного эпителия сетчатки (RPE). Установлено, что у мышей может развиться целый ряд патологий РПЭ. Здесь мы описываем протокол фенотипирования для выяснения и количественной оценки патологий RPE у мышей с использованием световой, просвечивающей электронной и конфокальной микроскопии.

Abstract

Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) является изнурительным заболеванием сетчатки у стареющего населения. Широко распространено мнение, что дисфункция пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) является ключевым патобиологическим событием при ВМД. Чтобы понять механизмы, которые приводят к дисфункции RPE, исследователи могут использовать модели мышей. Предыдущими исследованиями было установлено, что у мышей могут развиваться патологии РПЭ, некоторые из которых наблюдаются в глазах людей с диагнозом ВМД. Здесь мы описываем протокол фенотипирования для оценки патологий RPE у мышей. Этот протокол включает в себя подготовку и оценку поперечных срезов сетчатки с использованием световой микроскопии и просвечивающей электронной микроскопии, а также плоских креплений RPE с помощью конфокальной микроскопии. Мы подробно описываем распространенные типы патологий RPE у мышей, наблюдаемые с помощью этих методов, и способы их количественной оценки с помощью объективных методов статистического тестирования. В качестве доказательства концепции мы используем этот протокол фенотипирования RPE для количественной оценки патологий RPE, наблюдаемых у мышей с сверхэкспрессией трансмембранного белка 135 (Tmem135) и старых мышей C57BL / 6J дикого типа. Основная цель этого протокола — представить стандартные методы фенотипирования RPE с объективными количественными оценками для ученых, использующих мышиные модели ВМД.

Introduction

Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) является распространенным заболеванием, приводящим к слепоте, которое поражает население старше 55 лет¹. Многие исследователи считают, что дисфункция пигментного эпителия сетчатки (RPE) является ранним и важным патобиологическим событием при ВМД². RPE представляет собой монослой поляризованных клеток, которым поручено поддерживать гомеостаз соседних фоторецепторов и хориоидальных кровеносных сосудов³. Существует множество моделей для исследования связанных с заболеванием механизмов в RPE, включая модели^{клеточных культур 4,5} и мышей 6,7,8. В недавнем отчете были описаны стандартизированные протоколы и критерии контроля качества для моделей клеточных культур RPE⁴, но ни в одном отчете не было предпринято попыток стандартизировать фенотипирование RPE на моделях мышей. На самом деле, во многих публикациях, посвященных мышиным моделям ВМД, отсутствует полное описание РПЭ или количественная оценка патологий РПЭ в них. Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы представить стандартные методы фенотипирования RPE с непредвзятыми количественными оценками для ученых, использующих модели мышей AMD.

В предыдущих публикациях отмечалось наличие нескольких патологий RPE у мышей с помощью трех методов визуализации. Например, световая микроскопия позволяет исследователям просматривать общую морфологию сетчатки мышей (рис. 1A) и выявлять патологии RPE, такие как истончение RPE, вакуолизация и миграция. Истончение RPE в модели мыши AMD иллюстрируется отклонением высоты RPE от соответствующих элементов управления (рис. 1B). Вакуолизацию РПЭ можно разделить на две отдельные категории: микровакуолизация (рис. 1C) и макровакуолизация (рис. 1D). Микровакуолизация РПЭ суммируется наличием вакуолей в РПЭ, которые не влияют на его общую высоту, тогда как макровакуолизация обозначается наличием вакуолей, выступающих во внешние сегменты фоторецепторов. Миграция РПЭ отличается фокальным агрегатом пигмента над монослоем РПЭ в поперечном сечении сетчатки (рис. 1Е). Следует отметить, что мигрирующие клетки RPE в донорских глазах ВМД проявляют иммунореактивность к маркерам иммунных клеток, таким как кластер дифференцировки 68 (CD68)9, и могут представлять собой иммунные клетки, поглощающие обломки RPE, или RPE, подвергающиеся трансдифференцировке ⁹. Другой метод визуализации, называемый просвечивающей электронной микроскопией, может позволить исследователям визуализировать ультраструктуру RPE и его базальной мембраны (рис. 2A). Этот метод может идентифицировать преобладающее отложение суб-RPE у мышей, известное как базальное ламинарное отложение (BLamD) (рис. 2B)¹⁰. Наконец, конфокальная микроскопия может выявить структуру клеток RPE с помощью визуализации плоских креплений RPE (рис. 3A). Этот метод позволяет выявить дисморфию СИЗД, отклонение РПЭ от его классической сотовой формы (рис. 3Б). Он также может обнаруживать многоядерность RPE, наличие трех или более ядер в ячейке RPE (рис. 3C). Для краткого изложения типов патологий RPE, присутствующих в современных моделях мышей AMD, мы отсылаем исследователей к этим обзорам из литературы ^6,7.

Исследователи, изучающие ВМД, должны знать о преимуществах и недостатках использования мышей для исследования патологий РПЭ до протокола фенотипирования. Мыши выгодны из-за их относительно короткой продолжительности жизни и экономической эффективности, а также их генетической и фармакологической манипулятивности. У мышей также наблюдаются дегенеративные изменения RPE, включая миграцию RPE, дисморфию и многоядерность, которые наблюдаются в донорских глазах^AMD 11,12,13,14,15,16,17; это говорит о том, что подобные механизмы могут лежать в основе развития этих патологий RPE у мышей и людей. Тем не менее, есть ключевые различия, которые ограничивают переводимость исследований на мышах на ВМД человека. Во-первых, у мышей нет макулы, анатомически обособленной области сетчатки человека, необходимой для остроты зрения, которая преимущественно поражается при ВМД. Во-вторых, некоторые патологии RPE у мышей, такие как истончение RPE и вакуолизация, обычно не наблюдаются в донорских глазах^{AMD 18}. В-третьих, у мышей не развиваются друзы, что является отличительной чертой патологии ВМД¹⁹. Друзы представляют собой липид- и белковые отложения с очень небольшим количеством белков базальной мембраны, которые образуются между базальной пластинкой RPE и внутренним коллагеновым слоем мембраны Бруха (BrM)¹⁹. Друзы отличаются от BLamD, распространенного суб-РПЭ у мышей, как по составу, так и по анатомическому расположению. BLamD представляют собой зависимые от возраста и стресса аномалии, обогащенные внеклеточным матриксом, которые образуются между базальной пластинкой RPE BrM и базальными складками RPE²⁰. Интересно, что BLamD имеют схожий белковый состав и внешний вид как у мышей, так и у людей ^6,10,21. Недавняя работа предполагает, что BLamD могут влиять на патобиологию ВМД, влияя на прогрессирование ВМД до более поздних стадий^18,22; таким образом, эти отложения могут представлять собой пораженный RPE в сетчатке мыши. Знание этих преимуществ и ограничений имеет решающее значение для исследователей, заинтересованных в переводе результатов исследований на мышах в AMD.

В этом протоколе мы обсуждаем методы подготовки глаз к световой, просвечивающей электронной и конфокальной микроскопии для визуализации патологий RPE. Мы также описываем, как непредвзято количественно оценивать патологии RPE для статистического тестирования. В качестве доказательства концепции мы используем протокол фенотипирования RPE для исследования структурных патологий RPE, наблюдаемых у мышей с избыточной экспрессией трансмембранного белка 135- (Tmem135) и старых мышей дикого типа (WT) C57BL / 6J. Таким образом, мы стремимся описать методологию фенотипирования, чтобы охарактеризовать RPE в моделях мышей AMD, поскольку в настоящее время нет доступных стандартных протоколов. Исследователи, заинтересованные в изучении и количественной оценке патологий фоторецепторов или сосудистой оболочки, которые также поражаются на моделях мышей с ВМД, могут не счесть этот протокол полезным для своих исследований.

Protocol

Все процедуры, связанные с животными, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Висконсин-Мэдисон и соответствуют Заявлению Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) для использования животных в офтальмолог?…

Representative Results

Завершение протокола фенотипирования RPE, описанного в этой статье, обеспечивает количественный анализ структурных аномалий RPE, обычно наблюдаемых в мышиных моделях AMD. Чтобы подтвердить эффективность этого протокола, мы использовали его на мышах, которые, как известно, проявляют патол?…

Discussion

В этой статье мы представили протокол фенотипирования для оценки структурных патологий RPE мышиных моделей. Мы описали этапы, необходимые для обработки глаз для различных методов визуализации, включая световую, просвечивающую электронную и конфокальную микроскопию, а также количестве…

Materials

0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2	PolyScientiifc R&D Company	S1619
100 Capacity Slide Box			Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.)
100% Ethanol	MDS Warehouse	2292-CASE	Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks	Qosina	11069
1x Phosphate Buffer Solution (PBS)			Premade 1x PBS can be used in this protocol.
2.0 mL microtubes	Genesee Scientific	24-283-LR
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold	Electron Microscopy Sciences	70165
24 inch PVC Tubing with Luer Ends	Fisher Scientific	NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids	Electron Microscopy Sciences	T400-Cu
95% Ethanol	MDS Warehouse	2293-CASE
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches)	VWR	56616-031
Adjustable 237 ml  Spray Bottle	VWR	23609-182
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Aluminum Foil
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle	Sigma-Aldrich	Z192546
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width	Roboz Surgical Instrument	RS-5211	Known as curved forceps in this protocol.
Camel Hair Brush	Electron Microscopy Sciences	65575-02
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber
Carbon Dioxide Flow Meter
Carbon Dioxide Tank
Castaloy Prong Extension Clamps	Fisher Scientific	05-769-7Q
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand	Fisher Scientific	11-474-207
Cell Prolifer Program			Available to download: https://cellprofiler.org/releases
Clear Nail Polish	Electron Microscopy Sciences	72180
Colorfrost Microscope Slides Lavender	VWR	10118-956
Computer
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-5MG
Distilled H20			Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55	Roboz Surgical Instrument	RS-4984	Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).
Electron Microscopy Grid Holder	Electron Microscopy Sciences	71147-01
EPON 815 Resin	Electron Microscopy Sciences	14910
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye	Fisher Scientific	22050460	Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye.
Epredia Mounting Media	Fisher Scientific	22-110-610	Use for mounting H&E slides.
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source	Dolan-Jenner Industries	Mi-150	Light source for dissecting microscope.
Fiji ImageJ Program			Available to download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector	Thermo Scientific	14-666-18Q
Fume hood
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32%	Electron Microscopy Sciences	16537-05
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera
Laboratory Benchtop Shaker			Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.
Laser Cryo Tag Labels	Electron Microscopy Sciences	77564-05
Lead Citrate	Electron Microscopy Sciences	17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips	Thermo Fisher Scientific	22X22I24788001LS	Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.
Mayer's Hematoxylin	VWR	100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz Surgical Instrument	RS-5600	Known as micro-dissecting scissors in protocol.
Methanol	Fisher Scientific	A412-4
Mice			Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length	Roboz Surgical Instrument	RS-5913	Known as curved scissors in this protocol.
Microsoft Excel
Microtube racks
Nikon A1RS Confocal Microscope
Normal Donkey Serum	SouthernBiotech	0030-01
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades	VWR	21909-380
Osmium Tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19150
Paraformaldehyde, 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Pencil
Petri Dish	VWR	21909-380
Pipette Tips
Pipettes
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody	Thermo Fisher Scientific	402200
Propylene Oxide	Electron Microscopy Sciences	20412
Razor Blade	VWR	10040-386
Shallow Tray for Mouse Perfusions
Shandon Eosin Y Alcoholic	VWR	89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker	Staples	642736
Slide Rack for Staining	Grainger	49WF31
Squared Cover Glass Slips	Fisher Scientific	12-541B
Staining Dish with Cover	Grainger	49WF30	Need 15 for H&E staining procedure.
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe	Thermo Scientific	S7510-50	Use only the syringe barrel.
Timer	Fisher	1464917
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Vacuum Oven
Vectashield Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Use for mounting RPE flat mounts.
Xylene	Fisher Scientific	22050283
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope			This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching.
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope	Electron Microscopy Sciences	65575-02