Summary

Un protocolo para evaluar y cuantificar patologías del epitelio pigmentado retiniano en modelos murinos de degeneración macular relacionada con la edad

Published: March 10, 2023
doi:

Summary

Los modelos de ratón pueden ser herramientas útiles para investigar la biología del epitelio pigmentado de la retina (EPR). Se ha establecido que los ratones pueden desarrollar una serie de patologías del EPR. Aquí, describimos un protocolo de fenotipado para dilucidar y cuantificar patologías de EPR en ratones utilizando luz, electrones de transmisión y microscopía confocal.

Abstract

La degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) es un trastorno retiniano debilitante en las poblaciones que envejecen. Se cree ampliamente que la disfunción del epitelio pigmentado de la retina (EPR) es un evento patobiológico clave en la DMAE. Para comprender los mecanismos que conducen a la disfunción del EPR, los investigadores pueden utilizar modelos de ratón. Se ha establecido por estudios previos que los ratones pueden desarrollar patologías del EPR, algunas de las cuales se observan en los ojos de individuos diagnosticados con DMAE. Aquí, describimos un protocolo de fenotipado para evaluar patologías de EPR en ratones. Este protocolo incluye la preparación y evaluación de cortes transversales retinianos mediante microscopía óptica y microscopía electrónica de transmisión, así como la de montajes planos RPE por microscopía confocal. Detallamos los tipos comunes de patologías murinas del EPR observadas por estas técnicas y las formas de cuantificarlas a través de métodos imparciales para las pruebas estadísticas. Como prueba de concepto, utilizamos este protocolo de fenotipado de EPR para cuantificar las patologías del EPR observadas en ratones que sobreexpresan la proteína transmembrana 135 (Tmem135) y ratones envejecidos C57BL / 6J de tipo salvaje. El objetivo principal de este protocolo es presentar métodos estándar de fenotipado de EPR con evaluaciones cuantitativas imparciales para científicos que utilizan modelos de ratón de DMAE.

Introduction

La degeneración macular asociada a la edad (DMAE) es una enfermedad ceguera común que afecta a poblaciones mayores de 55 años1. Muchos investigadores creen que la disfunción dentro del epitelio pigmentado de la retina (EPR) es un evento patobiológico temprano y crucial en la DMAE2. El EPR es una monocapa de células polarizadas encargadas de mantener la homeostasis de los fotorreceptores vecinos y los vasos sanguíneos coroideos3. Existe una variedad de modelos para investigar los mecanismos asociados a la enfermedad dentro del EPR, incluidos los modelos de cultivo celular 4,5 y los ratones 6,7,8. Un informe reciente ha descrito protocolos estandarizados y criterios de control de calidad para modelos de cultivo celular de EPR4, sin embargo, ningún informe ha intentado estandarizar el fenotipado del EPR en modelos de ratón. De hecho, muchas publicaciones sobre modelos de ratón de DMAE carecen de una descripción completa del EPR o cuantificación de las patologías del EPR en ellos. El objetivo general de este protocolo es presentar métodos estándar de fenotipado de EPR con evaluaciones cuantitativas imparciales para científicos que utilizan modelos de ratón DMAE.

Publicaciones anteriores han observado la presencia de varias patologías del EPR en ratones a través de tres técnicas de imagen. Por ejemplo, la microscopía óptica permite a los investigadores ver la morfología macroscópica de la retina murina (Figura 1A) y detectar patologías del EPR como el adelgazamiento, la vacuolización y la migración del EPR. El adelgazamiento del EPR en un modelo de ratón AMD se ejemplifica mediante una desviación en la altura del EPR de sus respectivos controles (Figura 1B). La vacuolización del EPR se puede dividir en dos categorías separadas: microvacuolización (Figura 1C) y macrovacuolización (Figura 1D). La microvacuolización del EPR se resume en la presencia de vacuolas en el EPR que no afectan su altura total, mientras que la macrovacuolización está indicada por la presencia de vacuolas que sobresalen en los segmentos externos de los fotorreceptores. La migración del EPR se distingue por el agregado focal de pigmento por encima de la monocapa del EPR en una sección transversal retiniana (Figura 1E). Cabe señalar que las células migratorias del EPR en los ojos de los donantes de DMAE exhiben inmunorreactividad a los marcadores de células inmunitarias, como el grupo de diferenciación 68 (CD68)9, y podrían representar células inmunitarias que envuelven restos de EPR o EPR en transdiferenciación9. Otra técnica de imagen llamada microscopía electrónica de transmisión puede permitir a los investigadores visualizar la ultraestructura del EPR y su membrana basal (Figura 2A). Esta técnica puede identificar el depósito sub-EPR predominante en ratones, conocido como depósito laminar basal (BLamD) (Figura 2B)10. Por último, la microscopía confocal puede revelar la estructura de las células del EPR a través de montajes planos de imágenes del EPR (Figura 3A). Este método puede descubrir la dismorfia del EPR, la desviación del EPR de su forma clásica de panal (Figura 3B). También puede detectar la multinucleación del EPR, la presencia de tres o más núcleos dentro de una célula del EPR (Figura 3C). Para un resumen de los tipos de patologías del EPR presentes en los modelos actuales de ratón DMAE, remitimos a los investigadores a estas revisiones de la literatura 6,7.

Los investigadores que estudian la DMAE deben ser conscientes de las ventajas y desventajas de usar ratones para investigar patologías RPE antes del protocolo de fenotipado. Los ratones son ventajosos debido a su vida relativamente corta y rentabilidad, así como a su manipulabilidad genética y farmacológica. Los ratones también exhiben cambios degenerativos del EPR, incluyendo migración del EPR, dismorfia y multinucleación, que se observan en los ojos de los donantes de DMAE 11,12,13,14,15,16,17; esto sugiere que mecanismos similares pueden subyacer al desarrollo de estas patologías del EPR en ratones y humanos. Sin embargo, existen diferencias clave que limitan la traducibilidad de los estudios con ratones a la DMAE humana. Primero, los ratones no tienen una mácula, una región anatómicamente distinta de la retina humana necesaria para la agudeza visual que se ve afectada preferentemente en la DMAE. En segundo lugar, algunas patologías del EPR en ratones, como el adelgazamiento del EPR y la vacuolización, no se observan típicamente en los ojos de los donantes de DMAE18. En tercer lugar, los ratones no desarrollan drusas, un sello distintivo de la patología de la DMAE19. Las drusas son depósitos que contienen lípidos y proteínas con muy pocas proteínas de la membrana basal que se forman entre la lámina basal del EPR y la capa colágena interna de la membrana de Bruch (BrM)19. Las drusas difieren de BLamD, el depósito común de sub-RPE en ratones, tanto en su composición como en su ubicación anatómica. Los BLamD son anomalías enriquecidas con matriz extracelular dependientes de la edad y el estrés que se forman entre la lámina basal del EPR de BrM y los pliegues basales del EPR20. Curiosamente, los BLamD tienen una composición y apariencia de proteínas similares tanto en ratones como en humanos 6,10,21. Trabajos recientes sugieren que los BLamD pueden actuar en la patobiología de la DMAE al influir en la progresión de la DMAE a sus etapas posteriores18,22; por lo tanto, estos depósitos pueden representar EPR enfermo en la retina del ratón. El conocimiento de estos beneficios y limitaciones es fundamental para los investigadores interesados en traducir los resultados de los estudios con ratones a la DMAE.

En este protocolo, discutimos los métodos para preparar los ojos para la luz, el electrón de transmisión y la microscopía confocal para visualizar patologías de EPR. También describimos cómo cuantificar las patologías del EPR de manera imparcial para las pruebas estadísticas. Como prueba de concepto, utilizamos el protocolo de fenotipado de EPR para investigar las patologías estructurales del EPR observadas en ratones que sobreexpresan la proteína transmembrana 135- (Tmem135) y ratones envejecidos tipo salvaje (WT) C57BL / 6J. En resumen, nuestro objetivo es describir la metodología de fenotipado para caracterizar el EPR en modelos de ratón DMAE, ya que actualmente no hay protocolos estándar disponibles. Los investigadores interesados en examinar y cuantificar patologías de los fotorreceptores o coroides, que también se ven afectados en modelos de ratón DMAE, pueden no encontrar este protocolo útil para sus estudios.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran sujetos animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Wisconsin-Madison, y cumplen con la Declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el Uso de Animales en la Investigación Oftálmica y de la Visión. 1. Evaluación del EPR del ratón mediante microscopía óptica Haga un tampón fijador que tenga una concentración fi…

Representative Results

La finalización del protocolo de fenotipado del EPR descrito en este artículo proporciona un análisis cuantitativo de las anomalías estructurales del EPR comúnmente observadas en modelos de ratón de DMAE. Para confirmar la efectividad de este protocolo, lo utilizamos en ratones que se sabe que presentan patologías del EPR, incluidos los ratones transgénicos que sobreexpresan WT Tmem135 impulsado por el promotor de beta-actina de pollo (Tmem135 TG)30 y ratones C57BL / 6J envejecidos <sup class="x…

Discussion

En este artículo, presentamos un protocolo de fenotipado para evaluar las patologías estructurales del EPR de modelos de ratón. Describimos los pasos necesarios para procesar los ojos para diversas técnicas de imagen, incluida la luz, el electrón de transmisión y la microscopía confocal, así como la cuantificación de patologías típicas observadas a través de estos métodos de imagen. Demostramos la efectividad de nuestro protocolo de fenotipado de EPR examinando ratones Tmem135 TG y WT de 24…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer a Satoshi Kinoshita y al laboratorio de Iniciativas de Investigación Traslacional en Patología (TRIP) de la Universidad de Wisconsin (UW) por preparar nuestros tejidos para la microscopía óptica. Este núcleo cuenta con el apoyo del Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio de la Universidad de Wisconsin, el Centro de Cáncer Carbone de la Universidad de Wisconsin (P30 CA014520) y la Oficina del Director de los NIH (S10OD023526). La microscopía confocal se realizó en el Núcleo Óptico de Bioquímica de la UW, que se estableció con el apoyo del Departamento de Dotación de Bioquímica de la UW. Este trabajo también fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional del Ojo (R01EY022086 a A. Ikeda; R01EY031748 a C. Bowes Rickman; P30EY016665 al Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales de la UW; P30EY005722 al Duke Eye Center; NIH T32EY027721 a M. Landowski; F32EY032766 a M. Landowski), Presidente de Timothy William Trout (A. Ikeda), Premio FFB Free Family AMD (C. Bowes Rickman); y una subvención sin restricciones de la Investigación para Prevenir la Ceguera (Duke Eye Center).

Materials

0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2 PolyScientiifc R&D Company S1619
100 Capacity Slide Box Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.)
100% Ethanol  MDS Warehouse 2292-CASE Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks Qosina 11069
1x Phosphate Buffer Solution (PBS) Premade 1x PBS can be used in this protocol. 
2.0 mL microtubes Genesee Scientific  24-283-LR
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold Electron Microscopy Sciences 70165
24 inch PVC Tubing with Luer Ends Fisher Scientific NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids Electron Microscopy Sciences T400-Cu
95% Ethanol MDS Warehouse 2293-CASE
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches) VWR 56616-031
Adjustable 237 ml  Spray Bottle VWR 23609-182
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG  Thermo Fisher Scientific A-21206
Aluminum Foil
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle Sigma-Aldrich  Z192546
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width Roboz Surgical Instrument RS-5211 Known as curved forceps in this protocol.
Camel Hair Brush Electron Microscopy Sciences 65575-02
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber
Carbon Dioxide Flow Meter
Carbon Dioxide Tank
Castaloy Prong Extension Clamps Fisher Scientific  05-769-7Q
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand Fisher Scientific  11-474-207
Cell Prolifer Program Available to download: https://cellprofiler.org/releases
Clear Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
Colorfrost Microscope Slides Lavender VWR 10118-956
Computer
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
Distilled H20 Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55 Roboz Surgical Instrument RS-4984 Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).
Electron Microscopy Grid Holder Electron Microscopy Sciences 71147-01
EPON 815 Resin Electron Microscopy Sciences 14910
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye Fisher Scientific  22050460 Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye. 
Epredia Mounting Media Fisher Scientific 22-110-610 Use for mounting H&E slides. 
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source Dolan-Jenner Industries Mi-150 Light source for dissecting microscope.
Fiji ImageJ Program Available to download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector Thermo Scientific   14-666-18Q
Fume hood
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32% Electron Microscopy Sciences 16537-05
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera
Laboratory Benchtop Shaker Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.
Laser Cryo Tag Labels Electron Microscopy Sciences 77564-05
Lead Citrate Electron Microscopy Sciences 17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips Thermo Fisher Scientific 22X22I24788001LS Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.
Mayer's Hematoxylin VWR 100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors Roboz Surgical Instrument RS-5600 Known as micro-dissecting scissors in protocol. 
Methanol Fisher Scientific  A412-4
Mice Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length Roboz Surgical Instrument RS-5913 Known as curved scissors in this protocol.
Microsoft Excel
Microtube racks
Nikon A1RS Confocal Microscope
Normal Donkey Serum SouthernBiotech 0030-01
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades VWR 21909-380
Osmium Tetroxide  Electron Microscopy Sciences 19150
Paraformaldehyde, 32% Electron Microscopy Sciences 15714-S
Pencil
Petri Dish VWR  21909-380
Pipette Tips
Pipettes 
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody Thermo Fisher Scientific 402200
Propylene Oxide Electron Microscopy Sciences 20412
Razor Blade VWR 10040-386
Shallow Tray for Mouse Perfusions
Shandon Eosin Y Alcoholic VWR 89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker Staples 642736
Slide Rack for Staining Grainger 49WF31
Squared Cover Glass Slips Fisher Scientific  12-541B
Staining Dish with Cover Grainger 49WF30 Need 15 for H&E staining procedure.
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe  Thermo Scientific  S7510-50 Use only the syringe barrel.
Timer Fisher 1464917
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400
Vacuum Oven
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000 Use for mounting RPE flat mounts. 
Xylene Fisher Scientific  22050283
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching. 
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope Electron Microscopy Sciences 65575-02

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Landowski, M., Grindel, S., Hao, Y., Ikeda, S., Bowes Rickman, C., Ikeda, A. A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration. J. Vis. Exp. (193), e64927, doi:10.3791/64927 (2023).

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