Ett protokoll för att utvärdera och kvantifiera retinala pigmenterade epitelpatologier i musmodeller av åldersrelaterad makuladegeneration

Summary

Musmodeller kan vara användbara verktyg för att undersöka biologin hos retinalt pigmenterat epitel (RPE). Det har fastställts att möss kan utveckla en rad RPE-patologier. Här beskriver vi ett fenotypningsprotokoll för att belysa och kvantifiera RPE-patologier hos möss med hjälp av ljus, transmissionselektron och konfokalmikroskopi.

Abstract

Åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) är en försvagande retinal sjukdom hos åldrande befolkningar. Det anses allmänt att dysfunktion av retinal pigmenterat epitel (RPE) är en viktig patobiologisk händelse vid AMD. För att förstå mekanismerna som leder till RPE-dysfunktion kan musmodeller användas av forskare. Det har fastställts av tidigare studier att möss kan utveckla RPE-patologier, av vilka några observeras i ögonen på individer som diagnostiserats med AMD. Här beskriver vi ett fenotypningsprotokoll för att bedöma RPE-patologier hos möss. Detta protokoll innefattar beredning och utvärdering av retinala tvärsnitt med hjälp av ljusmikroskopi och transmissionselektronmikroskopi, liksom av RPE-plana fästen med konfokalmikroskopi. Vi beskriver de vanliga typerna av murina RPE-patologier som observeras av dessa tekniker och sätt att kvantifiera dem genom opartiska metoder för statistisk testning. Som bevis på konceptet använder vi detta RPE-fenotypningsprotokoll för att kvantifiera RPE-patologierna som observerats hos möss som överuttrycker transmembranprotein 135 (Tmem135) och åldrade vildtyp C57BL / 6J-möss. Huvudmålet med detta protokoll är att presentera standard RPE-fenotypningsmetoder med opartiska kvantitativa bedömningar för forskare som använder musmodeller av AMD.

Introduction

Åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) är en vanlig blindsjukdom som drabbar populationer över 55 år¹. Många forskare tror att dysfunktion i retinalpigmenterat epitel (RPE) är en tidig och avgörande patobiologisk händelse i AMD². RPE är ett monolager av polariserade celler som har till uppgift att upprätthålla homeostas hos närliggande fotoreceptorer och koroidala blodkärl³. En mängd olika modeller finns för att undersöka sjukdomsassocierade mekanismer inom RPE, inklusive cellodlingsmodeller ^4,5 och möss 6,7,8. En ny rapport har beskrivit standardiserade protokoll och kvalitetskontrollkriterier för RPE-cellodlingsmodeller⁴, men ingen rapport har försökt standardisera fenotypningen av RPE i musmodeller. Faktum är att många publikationer om musmodeller av AMD saknar en fullständig beskrivning av RPE eller kvantifiering av RPE-patologierna i dem. Det övergripande målet med detta protokoll är att presentera standard RPE-fenotypningsmetoder med opartiska kvantitativa bedömningar för forskare som använder AMD-musmodeller.

Tidigare publikationer har noterat förekomsten av flera RPE-patologier hos möss genom tre avbildningstekniker. Till exempel tillåter ljusmikroskopi forskare att se den murina näthinnans grova morfologi (figur 1A) och upptäcka RPE-patologier som RPE-gallring, vakuolisering och migration. RPE-gallring i en AMD-musmodell exemplifieras av en avvikelse i RPE-höjden från deras respektive kontroller (figur 1B). RPE-vakuolisering kan delas in i två separata kategorier: mikrovakuolisering (figur 1C) och makrovakuolisering (figur 1D). RPE-mikrovakuolisering sammanfattas av närvaron av vakuoler i RPE som inte påverkar dess totala höjd, medan makrovakuolisering indikeras av närvaron av vakuoler som sticker ut i fotoreceptorernas yttre segment. RPE-migration kännetecknas av fokalaggregatet av pigment ovanför RPE-monolagret i ett retinalt tvärsnitt (figur 1E). Det bör noteras att migrerande RPE-celler i AMD-donatorögon uppvisar immunreaktivitet mot immuncellmarkörer, såsom kluster av differentiering 68 (CD68)9, och kan representera immunceller som uppslukar RPE-skräp eller RPE som genomgår transdifferentiering⁹. En annan bildteknik som kallas transmissionselektronmikroskopi kan tillåta forskare att visualisera ultrastrukturen hos RPE och dess basalmembran (figur 2A). Denna teknik kan identifiera den dominerande sub-RPE-avlagringen hos möss, känd som den basala laminära avlagringen (BLamD) (figur 2B)¹⁰. Slutligen kan konfokalmikroskopi avslöja RPE-cellernas struktur genom att avbilda RPE-plana fästen (figur 3A). Denna metod kan avslöja RPE-dysmorfi, avvikelsen från RPE från dess klassiska bikakeform (figur 3B). Det kan också detektera RPE-multinukleation, närvaron av tre eller flera kärnor i en RPE-cell (figur 3C). För en sammanfattning av de typer av RPE-patologier som finns i nuvarande AMD-musmodeller hänvisar vi forskare till dessa recensioner från litteraturen ^6,7.

Forskare som studerar AMD bör vara medvetna om fördelarna och nackdelarna med att använda möss för att undersöka RPE-patologier före fenotypprotokollet. Möss är fördelaktiga på grund av deras relativt korta livslängd och kostnadseffektivitet, liksom deras genetiska och farmakologiska manipulerbarhet. Möss uppvisar också RPE-degenerativa förändringar, inklusive RPE-migration, dysmorfi och multinukleation, som observeras i AMD-donatorögon 11,12,13,14,15,16,17; Detta tyder på att liknande mekanismer kan ligga till grund för utvecklingen av dessa RPE-patologier hos möss och människor. Det finns dock viktiga skillnader som begränsar översättningsbarheten av musstudier till humant AMD. För det första har möss inte en makula, en anatomiskt distinkt region av den mänskliga näthinnan som är nödvändig för synskärpa som företrädesvis påverkas vid AMD. För det andra ses vissa RPE-patologier hos möss, som RPE-gallring och vakuolisering, vanligtvis inte i AMD-donatorögon¹⁸. För det tredje utvecklar möss inte drusen, ett kännetecken för AMD-patologi¹⁹. Drusen är lipid- och proteininnehållande avlagringar med mycket få basalmembranproteiner som bildas mellan RPE-basallamina och det inre kollagenskiktet i Bruchs membran (BrM)¹⁹. Drusen skiljer sig från BLamD, den vanliga sub-RPE-fyndigheten hos möss, både i deras sammansättning och anatomiska läge. BLamDs är ålders- och spänningsberoende extracellulära matrisberikade abnormiteter som bildas mellan RPE-basallamina i BrM och de basala invecklingarna i RPE²⁰. Intressant nog har BLamDs en liknande proteinsammansättning och utseende hos både möss och människor ^6,10,21. Nya arbeten tyder på att BLamDs kan verka i AMD: s patobiologi genom att påverka AMD: s progression till dess senare stadier^18,22; Således kan dessa avlagringar representera sjuk RPE i musnäthinnan. Kunskap om dessa fördelar och begränsningar är avgörande för forskare som är intresserade av att översätta resultat från musstudier till AMD.

I detta protokoll diskuterar vi metoderna för att förbereda ögon för ljus, transmissionselektron och konfokalmikroskopi för att visualisera RPE-patologier. Vi beskriver också hur man kvantifierar RPE-patologier på ett opartiskt sätt för statistisk testning. Som bevis på konceptet använder vi RPE-fenotypningsprotokollet för att undersöka de strukturella RPE-patologierna som observerats i transmembranprotein 135- (Tmem135) överuttryckande möss och åldrade vildtyp (WT) C57BL / 6J-möss. Sammanfattningsvis strävar vi efter att beskriva fenotypningsmetoden för att karakterisera RPE i AMD-musmodeller, eftersom det för närvarande inte finns några standardprotokoll tillgängliga. Forskare som är intresserade av att undersöka och kvantifiera patologier hos fotoreceptorerna eller choroid, som också påverkas i AMD-musmodeller, kanske inte tycker att detta protokoll är användbart för sina studier.

Protocol

Alla förfaranden som involverar djurämnen har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee vid University of Wisconsin-Madison och överensstämmer med Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. 1. Utvärdering av mus RPE med ljusmikroskopi Gör en fixativ buffert som har en slutlig koncentration av 2% paraformaldehyd och 2% glutaraldehyd vid rumstemperatur (RT) i en gl…

Representative Results

Slutförandet av RPE-fenotypningsprotokollet som beskrivs i denna artikel ger en kvantitativ analys av de strukturella RPE-avvikelser som vanligtvis observeras i musmodeller av AMD. För att bekräfta effektiviteten av detta protokoll använde vi det på möss som är kända för att visa RPE-patologier, inklusive transgena möss som överuttrycker WT Tmem135 som drivs av kycklingbeta-aktinpromotorn (Tmem135 TG)30 och åldrade C57BL / 6J-möss31,32.<…

Discussion

I den här artikeln introducerade vi ett fenotypprotokoll för att bedöma de strukturella RPE-patologierna hos musmodeller. Vi beskrev de steg som krävs för att bearbeta ögonen för olika avbildningstekniker inklusive ljus, transmissionselektron och konfokalmikroskopi, samt kvantifiering av typiska patologier observerade via dessa avbildningsmetoder. Vi bevisade effektiviteten av vårt RPE-fenotypningsprotokoll genom att undersöka Tmem135 TG och 24 månader gamla WT-möss, eftersom dessa möss visa…

Materials

0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2	PolyScientiifc R&D Company	S1619
100 Capacity Slide Box			Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.)
100% Ethanol	MDS Warehouse	2292-CASE	Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks	Qosina	11069
1x Phosphate Buffer Solution (PBS)			Premade 1x PBS can be used in this protocol.
2.0 mL microtubes	Genesee Scientific	24-283-LR
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold	Electron Microscopy Sciences	70165
24 inch PVC Tubing with Luer Ends	Fisher Scientific	NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids	Electron Microscopy Sciences	T400-Cu
95% Ethanol	MDS Warehouse	2293-CASE
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches)	VWR	56616-031
Adjustable 237 ml  Spray Bottle	VWR	23609-182
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Aluminum Foil
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle	Sigma-Aldrich	Z192546
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width	Roboz Surgical Instrument	RS-5211	Known as curved forceps in this protocol.
Camel Hair Brush	Electron Microscopy Sciences	65575-02
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber
Carbon Dioxide Flow Meter
Carbon Dioxide Tank
Castaloy Prong Extension Clamps	Fisher Scientific	05-769-7Q
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand	Fisher Scientific	11-474-207
Cell Prolifer Program			Available to download: https://cellprofiler.org/releases
Clear Nail Polish	Electron Microscopy Sciences	72180
Colorfrost Microscope Slides Lavender	VWR	10118-956
Computer
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-5MG
Distilled H20			Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55	Roboz Surgical Instrument	RS-4984	Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).
Electron Microscopy Grid Holder	Electron Microscopy Sciences	71147-01
EPON 815 Resin	Electron Microscopy Sciences	14910
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye	Fisher Scientific	22050460	Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye.
Epredia Mounting Media	Fisher Scientific	22-110-610	Use for mounting H&E slides.
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source	Dolan-Jenner Industries	Mi-150	Light source for dissecting microscope.
Fiji ImageJ Program			Available to download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector	Thermo Scientific	14-666-18Q
Fume hood
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32%	Electron Microscopy Sciences	16537-05
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera
Laboratory Benchtop Shaker			Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.
Laser Cryo Tag Labels	Electron Microscopy Sciences	77564-05
Lead Citrate	Electron Microscopy Sciences	17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips	Thermo Fisher Scientific	22X22I24788001LS	Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.
Mayer's Hematoxylin	VWR	100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz Surgical Instrument	RS-5600	Known as micro-dissecting scissors in protocol.
Methanol	Fisher Scientific	A412-4
Mice			Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length	Roboz Surgical Instrument	RS-5913	Known as curved scissors in this protocol.
Microsoft Excel
Microtube racks
Nikon A1RS Confocal Microscope
Normal Donkey Serum	SouthernBiotech	0030-01
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades	VWR	21909-380
Osmium Tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19150
Paraformaldehyde, 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Pencil
Petri Dish	VWR	21909-380
Pipette Tips
Pipettes
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody	Thermo Fisher Scientific	402200
Propylene Oxide	Electron Microscopy Sciences	20412
Razor Blade	VWR	10040-386
Shallow Tray for Mouse Perfusions
Shandon Eosin Y Alcoholic	VWR	89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker	Staples	642736
Slide Rack for Staining	Grainger	49WF31
Squared Cover Glass Slips	Fisher Scientific	12-541B
Staining Dish with Cover	Grainger	49WF30	Need 15 for H&E staining procedure.
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe	Thermo Scientific	S7510-50	Use only the syringe barrel.
Timer	Fisher	1464917
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Vacuum Oven
Vectashield Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Use for mounting RPE flat mounts.
Xylene	Fisher Scientific	22050283
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope			This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching.
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope	Electron Microscopy Sciences	65575-02