توحيد النقل عبر المختبرات بين أجهزة قياس التدفق الخلوي للكشف عن الخلايا الليمفاوية في الأطفال الذين تم تطعيمهم بالتهاب الدماغ الياباني
Summary
في هذه الدراسة ، تم تطوير طريقة لتسهيل نقل الإعدادات التجريبية وقوالب التحليل بين اثنين من مقاييس التدفق الخلوي في مختبرين للكشف عن الخلايا الليمفاوية في الأطفال اليابانيين الذين تم تطعيمهم ضد التهاب الدماغ. ستسمح طريقة التوحيد القياسي لتجارب مقياس التدفق الخلوي بإجراء مشاريع بحثية بفعالية في مراكز متعددة.
Abstract
يحتاج عدد متزايد من المختبرات إلى جمع البيانات من أجهزة قياس التدفق الخلوي المتعددة ، خاصة للمشاريع البحثية التي يتم إجراؤها عبر مراكز متعددة. تشمل تحديات استخدام مقياسين خلويين للتدفق في مختبرات مختلفة نقص المواد الموحدة ، ومشكلات توافق البرامج ، وعدم الاتساق في إعداد الأدوات ، واستخدام تكوينات مختلفة لأجهزة قياس التدفق الخلوي المختلفة. لإنشاء تجربة قياس التدفق الخلوي الموحدة لتحقيق اتساق وقابلية مقارنة النتائج التجريبية عبر مراكز متعددة ، تم إنشاء طريقة توحيد سريعة ومجدية لنقل المعلمات عبر مقاييس التدفق الخلوي المختلفة.
سمحت الطرق التي تم تطويرها في هذه الدراسة بنقل الإعدادات التجريبية وقوالب التحليل بين مقياسين للتدفق الخلوي في مختبرات مختلفة للكشف عن الخلايا الليمفاوية في الأطفال الذين تم تطعيمهم بالتهاب الدماغ الياباني (JE). تم الحصول على شدة مضان متسقة بين اثنين من أجهزة قياس الخلايا باستخدام حبات قياسية مضان لتحديد إعدادات مقياس الخلايا. تم الحصول على نتائج قابلة للمقارنة في مختبرين بأنواع مختلفة من الأدوات. باستخدام هذه الطريقة ، يمكننا توحيد التحليل لتقييم الوظيفة المناعية للأطفال الذين تم تطعيمهم في JE في مختبرات مختلفة بأدوات مختلفة ، وتقليل الاختلافات في البيانات والنتائج بين أجهزة قياس التدفق الخلوي في مراكز متعددة ، وتوفير نهج عملي للاعتماد المتبادل لنتائج المختبر. ستضمن طريقة التوحيد القياسي لتجارب مقياس التدفق الخلوي الأداء الفعال للمشاريع البحثية عبر مراكز متعددة.
Introduction
يعد توحيد قياس التدفق الخلوي مفيدا لمقارنة النتائج التي تم الحصول عليها من أجهزة قياس الخلايا المختلفة عبر المختبرات ومراكز الدراسة المختلفة ، ويؤدي إلى الاعتراف المتبادل بالنتائج لتحسين كفاءة العمل. وهناك عدد متزايد من السيناريوهات التي تتطلب توحيدا. أثناء عملية تطوير الدواء ، يعد توحيد قياس التدفق الخلوي أمرا مهما ، حيث أن الفحص المطور والمعتمد سيدعم عملية تطوير الدواء بأكملها من التحليل قبل السريري إلى التحليل السريري. كثيرا ما يتم نقل طرق قياس التدفق الخلوي بين صناعة الأدوية والمختبرات المتعاونة1. علاوة على ذلك ، من الضروري الحصول على بيانات قابلة للمقارنة من الدراسات السريرية متعددة المراكز. على سبيل المثال ، تم تطوير سير عمل التوحيد القياسي في مشروع الأبحاث السريرية متعددة المراكز لأمراض المناعة الذاتية الجهازية للحصول على بيانات قابلة للمقارنة من قياس التدفق الخلوي متعدد المراكز2.
توحيد طرق قياس التدفق الخلوي يمثل تحديا. تعزى التحديات التي تواجهها المختبرات إلى نقص المواد الموحدة ، ومشكلات توافق البرامج ، وعدم الاتساق في إعداد الأدوات ، واستخدام تكوينات مختلفة بين مقاييس التدفق الخلوي المختلفة واستراتيجيات البوابات المتباينة بين المراكز 3,4. لذلك ، من المهم إجراء تحليل الفجوة بين المختبرات. يجب مراجعة الوصول إلى العينات وأنظمة الجودة ومؤهلات الموظفين وتكوين الأداة لضمان تلبية المتطلبات.
في الوقت الحاضر ، الأطفال الذين تم تطعيمهم بلقاح التهاب الدماغ الياباني (JE) لديهم انخفاض كبير في حدوث JE5. يمكن أن تساعد مراقبة الخلايا المناعية للدم المحيطي في فهم التغيرات في المناعة التكيفية بوساطة الخلايا بعد التطعيم ، والعلاقة بين التغيرات في المجموعات الفرعية للخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي وتأثيرات التطعيم. نظرا للاستقرار المحدود لعينات الدم الكاملة ، غالبا ما يتم إجراء تقييمات لفعالية اللقاح في مراكز متعددة. في هذا التحليل ، حددنا خلايا CD8 + أو CD4 + T الساذجة على أنها CD27 + CD45RA+ ، وخلايا الذاكرة التائية المركزية (TCM) على أنها CD27 + CD45RA- ، والخلايا التائية للذاكرة المستجيبة (TEM) على أنها CD27- CD45RA- ، والخلايا التائية للذاكرة المستجيبة المتمايزة نهائيا (TEMRA) على أنها CD27– CD45RA+. يمكن فصل خلايا CD19 + B إلى مجموعات تعبر عن CD27 مقابل IgD 6,7 ، ويمكن تحديد الخلايا البائية الساذجة التي تعبر عن خلايا الذاكرة البائية CD27n (mBCs) بناء على تعبير IgD6 ، ويمكن تحديد الخلايا التائية التنظيمية (Tregs) على أنها CD4 + CD25 + + CD127 منخفضة 8. لإنشاء تجربة موحدة لقياس التدفق الخلوي لتحقيق اتساق وقابلية مقارنة النتائج التجريبية في مراكز متعددة ، تم إنشاء طريقة توحيد سريعة ومجدية لتسهيل نقل البروتوكولات عبر أجهزة قياس التدفق الخلوي المختلفة للكشف عن الخلايا الليمفاوية في الدم الكامل للأطفال الذين تم تطعيمهم ب JE. تم تجنيد ستة أطفال أصحاء (2 سنة) من مستشفى بكين للأطفال ، جامعة العاصمة الطبية. بعد تلقي التطعيم الأولي والتطعيم المعزز بلقاح JE SA14-14-2 الموهن الحي قبل أقل من 6 أشهر ، تم جمع عينات الدم المحيطية من المتطوعين. تم الحصول على بيانات قابلة للمقارنة بدرجة كبيرة من أدوات مختلفة باتباع إجراءات موحدة ، وهو أمر مفيد للتقييمات متعددة المراكز.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن أن يساعد التنميط المناعي للمجموعات الفرعية من الخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي في فهم التغيرات في المناعة التكيفية بوساطة الخلايا بعد التطعيم لدى الأطفال. في التطبيقات السريرية ، تحدث حالات غير متوقعة ، مثل الفشل في اكتشاف العينات في الوقت المناسب أو استبدال مقياس التدفق الخلوي ؛…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم RW من قبل مؤسسة بكين للعلوم الطبيعية ، الصين (رقم 7222059) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82002130) ، وتم دعم XZ من قبل صندوق CAMS للابتكار للعلوم الطبية (رقم 2019-I2M-5-026).
Materials
| BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | compensation |
| BD FACSCanto | BD | FACSCanto | flow Cytometry A in the transferring lab |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD | 655051 | define flow cytometer baseline and track cytometer performance |
| BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127 | BD | 562436 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27 | BD | 562656 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560777 | Fluorescent antibody |
| BD LSRFortessa | BD | LSRFortessa | flow Cytometry B in the test method lab |
| BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19 | BD | 745907 | Fluorescent antibody |
| BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8 | BD | 751953 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA | BD | 550855 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3 | BD | 560176 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD | 566320 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25 | BD | 555432 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD | BD | 561314 | Fluorescent antibody |
| Brilliant Staining Buffer Plus | BD | 566385 | Staining Buffer |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 | Cell centrifugation |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| CS&T IVD Beads | BD | 662414 | standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer |
| Lysing Solution 10x Concentrate | BD | 349202 | lysing red blood cells |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | PBS |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
References
- Cabanski, M., et al. Flow cytometric method transfer: Recommendations for best practice. Cytometry Part B. Clinical Cytometry. 100 (1), 52-62 (2021).
- Le Lann, L., et al. Standardization procedure for flow cytometry data harmonization in prospective multicenter studies. Scientific Reports. 10 (1), 11567 (2020).
- Linskens, E., et al. Improved standardization of flow cytometry diagnostic screening of primary immunodeficiency by software-based automated gating. Frontiers in Immunology. 11, 584646 (2020).
- Glier, H., et al. Standardization of 8-color flow cytometry across different flow cytometer instruments: A feasibility study in clinical laboratories in Switzerland. Journal of Immunological Methods. 475, 112348 (2019).
- Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLOS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), e0010562 (2022).
- Ding, Y., et al. Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (3), 970-973 (2018).
- Zhang, L., et al. Detection of polyfunctional T cells in children vaccinated with Japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique. Journal of Visualized Experiments. (187), e64671 (2022).
- Yu, N., et al. CD4(+) CD25 (+) CD127 (low/-) T cells: a more specific Treg population in human peripheral blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1180 (2012).
- Kalina, T. Reproducibility of flow cytometry through standardization: opportunities and challenges. Cytometry Part A. 97 (2), 137-147 (2020).
- Sommer, U., et al. Implementation of highly sophisticated flow cytometry assays in multicenter clinical studies: considerations and guidance. Bioanalysis. 7 (10), 1299-1311 (2015).
- Glier, H., et al. Comments on EuroFlow standard operating procedures for instrument setup and compensation for BD FACS Canto II, Navios and BD FACS Lyric instruments. Journal of Immunological Methods. 475, 112680 (2019).
