Standardisering af overførsel på tværs af laboratorier mellem flowcytometre til påvisning af lymfocytter hos japanske encefalitisvaccinerede børn

Summary

I denne undersøgelse blev der udviklet en metode til at lette overførslen af eksperimentelle indstillinger og analyseskabeloner mellem to flowcytometre i to laboratorier til påvisning af lymfocytter hos japanske encefalitisvaccinerede børn. Standardiseringsmetoden til flowcytometereksperimenterne gør det muligt at gennemføre forskningsprojekter effektivt i flere centre.

Abstract

Et stigende antal laboratorier har brug for at indsamle data fra flere flowcytometre, især til forskningsprojekter udført på tværs af flere centre. Udfordringerne ved at bruge to flowcytometre i forskellige laboratorier inkluderer manglen på standardiserede materialer, softwarekompatibilitetsproblemer, uoverensstemmelser i instrumentopsætning og brugen af forskellige konfigurationer til forskellige flowcytometre. For at etablere et standardiseret flowcytometrieksperiment for at opnå konsistens og sammenlignelighed af eksperimentelle resultater på tværs af flere centre blev der etableret en hurtig og gennemførlig standardiseringsmetode til overførsel af parametre på tværs af forskellige flowcytometre.

Metoderne udviklet i denne undersøgelse tillod overførsel af eksperimentelle indstillinger og analyseskabeloner mellem to flowcytometre i forskellige laboratorier til påvisning af lymfocytter hos japanske encefalitis (JE) -vaccinerede børn. En konsistent fluorescensintensitet blev opnået mellem de to cytometre ved anvendelse af fluorescensstandardperler til at etablere cytometerindstillingerne. Sammenlignelige resultater blev opnået i to laboratorier med forskellige typer instrumenter. Ved hjælp af denne metode kan vi standardisere analyse til evaluering af immunfunktionen hos JE-vaccinerede børn i forskellige laboratorier med forskellige instrumenter, mindske forskellene i data og resultater blandt flowcytometre i flere centre og give en gennemførlig tilgang til gensidig akkreditering af laboratorieresultater. Standardiseringsmetoden for flowcytometereksperimenter vil sikre effektiv udførelse af forskningsprojekter på tværs af flere centre.

Introduction

Standardiseringen af flowcytometri er nyttig til sammenlignelighed af resultater opnået fra forskellige cytometre på tværs af forskellige laboratorier og studiecentre og bidrager til gensidig anerkendelse af resultater for at forbedre arbejdseffektiviteten. Et stigende antal scenarier kræver standardisering. Under lægemiddeludviklingsprocessen er flowcytometristandardisering vigtig, da et udviklet og valideret assay vil understøtte hele lægemiddeludviklingsprocessen fra præklinisk til klinisk analyse. Flowcytometriske metoder overføres ofte mellem medicinalindustrien og samarbejdende laboratorier¹. Desuden er det vigtigt at indhente sammenlignelige data fra multicentriske kliniske undersøgelser. For eksempel blev der udviklet en standardiseringsarbejdsgang i det systemiske autoimmune sygdomme Multicenter Clinical Research Project for at opnå sammenlignelige data fra multicentrisk flowcytometri².

Standardiseringen af flowcytometrimetoder er udfordrende. De udfordringer, der opleves på tværs af laboratorier, tilskrives manglen på standardiserede materialer, softwarekompatibilitetsproblemer, uoverensstemmelser i instrumentopsætning og brugen af forskellige konfigurationer blandt forskellige flowcytometre og divergerende gatingstrategier mellem centrene ^3,4. Derfor er det vigtigt at foretage en gap-analyse mellem laboratorier. Adgang til prøver, kvalitetssystemer, personalekvalifikationer og instrumentkonfiguration skal gennemgås for at sikre, at kravene er opfyldt.

På nuværende tidspunkt har børn, der er vaccineret med den japanske encefalitis (JE) vaccine, en signifikant reduceret forekomst af JE⁵. Overvågning af perifere blodimmunceller kan hjælpe med at forstå ændringerne i cellemedieret adaptiv immunitet efter vaccination og sammenhængen mellem ændringerne i perifere blodlymfocytundergrupper og virkningerne af vaccination. På grund af den begrænsede stabilitet af fuldblodsprøver udføres evalueringer af vaccineeffektivitet ofte i flere centre. Til denne analyse definerede vi naive CD8+- eller CD4+ T-celler som CD27+ CD45RA+, T-celler med central hukommelse (T_CM) som CD27+ CD45RA-, effektorhukommelses-T-celler (T_EM) som CD27- CD45RA- og terminalt differentierede effektorhukommelses-T-celler (T_EMRA) som CD27^– CD45RA⁺. CD19⁺ B-celler kan opdeles i populationer, der udtrykker CD27 versus IgD ^6,7, naive B-celler udtrykker CD27n-hukommelse B-celler (mBC’er) kan identificeres baseret på ekspressionen af IgD ^6, og regulatoriske T-celler (Tregs) kan identificeres som CD4⁺CD25⁺⁺CD127^{lav 8}. For at etablere et standardiseret flowcytometrieksperiment for at opnå konsistens og sammenlignelighed af eksperimentelle resultater i flere centre blev der etableret en hurtig og gennemførlig standardiseringsmetode for at lette overførslen af protokoller på tværs af forskellige flowcytometre til påvisning af lymfocytter i fuldblod hos JE-vaccinerede børn. Seks raske børn (2 år) blev rekrutteret fra Beijing Children’s Hospital, Capital Medical University. Efter at have modtaget en prime og boost vaccination med en levende svækket JE SA14-14-2 vaccine mindre end 6 måneder før, blev perifere blodprøver indsamlet fra de frivillige. Meget sammenlignelige data blev opnået fra forskellige instrumenter efter standardiserede procedurer, hvilket er nyttigt for multicentervurderinger.

Protocol

Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité for Beijing Children’s Hospital, Capital Medical University (godkendelsesnummer: 2020-k-85). Informeret samtykke fra forsøgspersoner blev frafaldet, da kun restprøver efter klinisk test blev anvendt i denne undersøgelse. To laboratorier er involveret i denne undersøgelse. Det overførende laboratorium er, hvor den standardiserede metode blev udviklet ved hjælp af et flowcytometer. Cytometeret i dette laboratorium kaldes i det følgende cytom…

Representative Results

Figur 1 viser et globalt regneark med målværdiskabelonen for CST’s lyse perler. Ved hjælp af et FSC / SSC-plot tegnes en polygonport for at vælge CST-lyse perler. Histogramplots af 10 fluorescenskanaler blev opnået for CST lyse perler: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 og BV605. Målværdien for hver parameter vises ved at vise medianen inden for histogramportene i tabel 2. Skærmbillederne af skabeloner og parameterindstillinger i softwaren til cy…

Discussion

Immunofænotypning af perifere blodlymfocytundergrupper kan hjælpe med at forstå ændringerne i cellemedieret adaptiv immunitet efter vaccination hos børn. I kliniske applikationer opstår der uventede situationer, såsom manglende detektering af prøver rettidigt eller udskiftning af et flowcytometer; Derfor er der brug for hurtige standardiserede metoder, der letter overførsler mellem flowcytometre i forskellige laboratorier 9,10,11.<sup class="x…

Materials

BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843	compensation
BD FACSCanto	BD	FACSCanto	flow Cytometry A in the transferring lab
BD FACSDiva CS&T Research Beads	BD	655051	define flow cytometer baseline and track cytometer performance
BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127	BD	562436	Fluorescent antibody
BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27	BD	562656	Fluorescent antibody
BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45	BD	560777	Fluorescent antibody
BD LSRFortessa	BD	LSRFortessa	flow Cytometry B in the test method lab
BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19	BD	745907	Fluorescent antibody
BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8	BD	751953	Fluorescent antibody
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA	BD	550855	Fluorescent antibody
BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3	BD	560176	Fluorescent antibody
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4	BD	566320	Fluorescent antibody
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25	BD	555432	Fluorescent antibody
BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD	BD	561314	Fluorescent antibody
Brilliant Staining Buffer Plus	BD	566385	Staining Buffer
Centrifuge	Eppendorf	5810	Cell centrifugation
Centrifuge Tube	BD Falcon	BD-35209715	15 mL centrifuge tube
CS&T IVD Beads	BD	662414	standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer
Lysing Solution 10x Concentrate	BD	349202	lysing red blood cells
Phosphate-buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023	PBS
Round-bottom test tube	BD Falcon	352235	5 mL test tube