Standardizzazione del trasferimento tra laboratori tra citometri a flusso per il rilevamento di linfociti in bambini vaccinati contro l'encefalite giapponese

Summary

In questo studio, è stato sviluppato un metodo per facilitare il trasferimento di impostazioni sperimentali e modelli di analisi tra due citometri a flusso in due laboratori per la rilevazione di linfociti in bambini vaccinati contro l’encefalite giapponese. Il metodo di standardizzazione per gli esperimenti di citometro a flusso consentirà di condurre efficacemente i progetti di ricerca in più centri.

Abstract

Un numero crescente di laboratori ha bisogno di raccogliere dati da più citometri a flusso, in particolare per i progetti di ricerca eseguiti in più centri. Le sfide legate all’utilizzo di due citometri a flusso in laboratori diversi includono la mancanza di materiali standardizzati, problemi di compatibilità software, incongruenze nella configurazione degli strumenti e l’uso di configurazioni diverse per diversi citometri a flusso. Per stabilire un esperimento standardizzato di citometria a flusso per ottenere la coerenza e la comparabilità dei risultati sperimentali tra più centri, è stato stabilito un metodo di standardizzazione rapido e fattibile per trasferire i parametri tra diversi citometri a flusso.

I metodi sviluppati in questo studio hanno permesso il trasferimento di impostazioni sperimentali e modelli di analisi tra due citometri a flusso in diversi laboratori per la rilevazione di linfociti in bambini vaccinati con encefalite giapponese (JE). Un’intensità di fluorescenza costante è stata ottenuta tra i due citometri utilizzando sfere standard di fluorescenza per stabilire le impostazioni del citometro. Risultati comparabili sono stati ottenuti in due laboratori con diversi tipi di strumenti. Utilizzando questo metodo, possiamo standardizzare l’analisi per valutare la funzione immunitaria dei bambini vaccinati con JE in diversi laboratori con strumenti diversi, diminuire le differenze nei dati e nei risultati tra i citometri a flusso in più centri e fornire un approccio fattibile per l’accreditamento reciproco dei risultati di laboratorio. Il metodo di standardizzazione degli esperimenti di citometro a flusso garantirà l’efficace esecuzione dei progetti di ricerca in più centri.

Introduction

La standardizzazione della citometria a flusso è utile per la comparabilità dei risultati ottenuti da diversi citometri tra diversi laboratori e centri di studio e favorisce il riconoscimento reciproco dei risultati per migliorare l’efficienza del lavoro. Un numero crescente di scenari richiede una standardizzazione. Durante il processo di sviluppo del farmaco, la standardizzazione della citometria a flusso è importante, poiché un test sviluppato e convalidato supporterà l’intero processo di sviluppo del farmaco dall’analisi preclinica a quella clinica. I metodi citometrici a flusso sono spesso trasferiti tra l’industria farmaceutica e i laboratori che collaborano¹. Inoltre, è essenziale ottenere dati comparabili da studi clinici multicentrici. Ad esempio, è stato sviluppato un flusso di lavoro di standardizzazione nel progetto di ricerca clinica multicentrica sulle malattie autoimmuni sistemiche per ottenere dati comparabili dalla citometria a flusso multicentrica².

La standardizzazione dei metodi di citometria a flusso è impegnativa. Le sfide incontrate nei laboratori sono attribuite alla mancanza di materiali standardizzati, problemi di compatibilità software, incongruenze nella configurazione degli strumenti e l’uso di diverse configurazioni tra diversi citometri a flusso e strategie di gating divergenti tra i centri ^3,4. Pertanto, è importante condurre un’analisi del divario tra i laboratori. L’accesso ai campioni, i sistemi di qualità, le qualifiche del personale e la configurazione degli strumenti devono essere rivisti per garantire che i requisiti siano soddisfatti.

Attualmente, i bambini vaccinati con il vaccino contro l’encefalite giapponese (JE) hanno un’incidenza significativamente ridotta di JE⁵. Il monitoraggio delle cellule immunitarie del sangue periferico può aiutare a comprendere i cambiamenti nell’immunità adattativa cellulo-mediata dopo la vaccinazione e la correlazione tra i cambiamenti nei sottogruppi di linfociti del sangue periferico e gli effetti della vaccinazione. A causa della limitata stabilità dei campioni di sangue intero, le valutazioni dell’efficacia del vaccino vengono spesso eseguite in più centri. Per questa analisi, abbiamo definito le cellule T CD8+ o CD4+ naïve come CD27+ CD45RA+, le cellule T della memoria centrale (T_CM) come CD27+ CD45RA^, le cellule T della memoria effettrice (T_EM) come CD27-CD45RA^– e le cellule T della memoria effettrice terminalmente differenziata (T_EMRA) come CD27-CD45RA⁺. Le cellule B CD19⁺ possono essere separate in popolazioni che esprimono CD27 rispetto a IgD ^6,7, le cellule B naïve esprimono le cellule B di memoria CD27n (mBC) possono essere identificate in base all’espressione di IgD⁶ e le cellule T regolatorie (Treg) possono essere identificate come CD4⁺CD25⁺⁺CD127^{basso 8}. Per stabilire un esperimento standardizzato di citometria a flusso per ottenere la coerenza e la comparabilità dei risultati sperimentali in più centri, è stato stabilito un metodo di standardizzazione rapido e fattibile per facilitare il trasferimento di protocolli attraverso diversi citometri a flusso per la rilevazione di linfociti nel sangue intero di bambini vaccinati con JE. Sei bambini sani (2 anni) sono stati reclutati dall’ospedale pediatrico di Pechino, Capital Medical University. Dopo aver ricevuto una vaccinazione primaria e boost con un vaccino JE SA14-14-2 vivo attenuato meno di 6 mesi prima, sono stati raccolti campioni di sangue periferico dai volontari. Dati altamente comparabili sono stati ottenuti da diversi strumenti seguendo procedure standardizzate, il che è utile per le valutazioni multicentriche.

Protocol

Lo studio è stato approvato dal Comitato etico dell’ospedale pediatrico di Pechino, Capital Medical University (numero di approvazione: 2020-k-85). Il consenso informato dei soggetti umani è stato rinunciato poiché in questo studio sono stati utilizzati solo campioni residui dopo test clinici. Due laboratori sono coinvolti in questo studio. Il laboratorio di trasferimento è dove il metodo standardizzato è stato sviluppato utilizzando un citometro a flusso. Il citometro in questo laboratorio è di se…

Representative Results

Nella Figura 1 viene illustrato un foglio di lavoro globale del modello di valore di destinazione per le perline luminose CST. Utilizzando un plottaggio FSC/SSC, viene disegnato un cancello poligonale per selezionare le perline luminose CST. Sono stati ottenuti grafici istografici di 10 canali di fluorescenza per le sfere luminose CST: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 e BV605. Il valore di destinazione per ciascun parametro viene visualizzato mostrando la mediana all’i…

Discussion

L’immunofenotipizzazione dei sottogruppi di linfociti del sangue periferico può aiutare a comprendere i cambiamenti nell’immunità adattativa cellulo-mediata dopo la vaccinazione nei bambini. Nelle applicazioni cliniche si verificano situazioni impreviste, come la mancata rilevazione tempestiva dei campioni o la sostituzione di un citometro a flusso; Pertanto, sono necessari metodi standardizzati rapidi che facilitino i trasferimenti tra citometri a flusso in diversi laboratori 9,10,11.^</sup…

Materials

BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843	compensation
BD FACSCanto	BD	FACSCanto	flow Cytometry A in the transferring lab
BD FACSDiva CS&T Research Beads	BD	655051	define flow cytometer baseline and track cytometer performance
BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127	BD	562436	Fluorescent antibody
BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27	BD	562656	Fluorescent antibody
BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45	BD	560777	Fluorescent antibody
BD LSRFortessa	BD	LSRFortessa	flow Cytometry B in the test method lab
BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19	BD	745907	Fluorescent antibody
BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8	BD	751953	Fluorescent antibody
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA	BD	550855	Fluorescent antibody
BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3	BD	560176	Fluorescent antibody
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4	BD	566320	Fluorescent antibody
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25	BD	555432	Fluorescent antibody
BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD	BD	561314	Fluorescent antibody
Brilliant Staining Buffer Plus	BD	566385	Staining Buffer
Centrifuge	Eppendorf	5810	Cell centrifugation
Centrifuge Tube	BD Falcon	BD-35209715	15 mL centrifuge tube
CS&T IVD Beads	BD	662414	standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer
Lysing Solution 10x Concentrate	BD	349202	lysing red blood cells
Phosphate-buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023	PBS
Round-bottom test tube	BD Falcon	352235	5 mL test tube