I denne studien ble det utviklet en metode for å lette overføringen av eksperimentelle innstillinger og analysemaler mellom to strømningscytometre i to laboratorier for påvisning av lymfocytter hos japanske encefalittvaksinerte barn. Standardiseringsmetoden for flowcytometereksperimenter vil tillate forskningsprosjekter å bli effektivt utført i flere sentre.
Et økende antall laboratorier trenger å samle inn data fra flere strømningscytometre, spesielt for forskningsprosjekter utført på tvers av flere sentre. Utfordringene ved bruk av to flowcytometre i forskjellige laboratorier inkluderer mangel på standardiserte materialer, programvarekompatibilitetsproblemer, inkonsekvenser i instrumentoppsett og bruk av forskjellige konfigurasjoner for forskjellige flowcytometre. For å etablere et standardisert flowcytometrieksperiment for å oppnå konsistens og sammenlignbarhet av eksperimentelle resultater på tvers av flere sentre, ble det etablert en rask og gjennomførbar standardiseringsmetode for å overføre parametere på tvers av forskjellige flowcytometre.
Metodene utviklet i denne studien tillot overføring av eksperimentelle innstillinger og analysemaler mellom to flowcytometre i forskjellige laboratorier for påvisning av lymfocytter hos japanske encefalitt (JE) -vaksinerte barn. En konsistent fluorescensintensitet ble oppnådd mellom de to cytometrene ved bruk av fluorescensstandardperler for å etablere cytometerinnstillingene. Sammenlignbare resultater ble oppnådd i to laboratorier med forskjellige typer instrumenter. Ved hjelp av denne metoden kan vi standardisere analyse for evaluering av immunfunksjonen til JE-vaksinerte barn i forskjellige laboratorier med forskjellige instrumenter, redusere forskjellene i data og resultater mellom flowcytometre i flere sentre, og gi en gjennomførbar tilnærming for gjensidig akkreditering av laboratorieresultater. Standardiseringsmetoden for flowcytometereksperimenter vil sikre effektiv ytelse av forskningsprosjekter på tvers av flere sentre.
Standardiseringen av flowcytometri er nyttig for sammenlignbarheten av resultater oppnådd fra forskjellige cytometre på tvers av forskjellige laboratorier og studiesentre, og bidrar til gjensidig anerkjennelse av resultater for å forbedre arbeidseffektiviteten. Stadig flere scenarier krever standardisering. Under legemiddelutviklingsprosessen er standardisering av flowcytometri viktig, da en utviklet og validert analyse vil støtte hele legemiddelutviklingsprosessen fra preklinisk til klinisk analyse. Flowcytometriske metoder overføres ofte mellom farmasøytisk industri og samarbeidende laboratorier1. Videre er det viktig å innhente sammenlignbare data fra multisentriske kliniske studier. For eksempel ble det utviklet en standardiseringsarbeidsflyt i Systemic Autoimmune Diseases Multicenter Clinical Research Project for å oppnå sammenlignbare data fra multisentrisk flowcytometri2.
Standardisering av flowcytometrimetoder er utfordrende. Utfordringene som oppleves på tvers av laboratorier tilskrives mangelen på standardiserte materialer, programvarekompatibilitetsproblemer, inkonsekvenser i instrumentoppsett og bruk av forskjellige konfigurasjoner mellom forskjellige strømningscytometre og divergerende gatingstrategier mellom sentrene 3,4. Derfor er det viktig å gjennomføre en gapanalyse mellom laboratorier. Prøvetilgang, kvalitetssystemer, personellkvalifikasjoner og instrumentkonfigurasjon må gjennomgås for å sikre at kravene oppfylles.
For tiden har barn vaksinert med den japanske encefalittvaksinen (JE) en signifikant redusert forekomst av JE5. Overvåking av perifere blodimmunceller kan bidra til å forstå endringene i cellemediert adaptiv immunitet etter vaksinasjon, og sammenhengen mellom endringene i undergrupper av perifere lymfocytter i blodet og effekten av vaksinasjon. På grunn av den begrensede stabiliteten til fullblodprøver, blir evalueringer av vaksineeffekt ofte utført i flere sentre. For denne analysen definerte vi naive CD8+- eller CD4+ T-celler som CD27+ CD45RA+, sentrale minne-T-celler (TCM) som CD27+ CD45RA-, effektorminne-T-celler (TEM) som CD27-CD45RA-, og terminalt differensierte effektorminne-T-celler (TEMRA) som CD27– CD45RA+. CD19+ B-celler kan deles inn i populasjoner som uttrykker CD27 versus IgD 6,7, naive B-celler uttrykker CD27n-minne B-celler (mBC) kan identifiseres basert på ekspresjonen av IgD6, og regulatoriske T-celler (Tregs) kan identifiseres som CD4+CD25++CD127lav 8. For å etablere et standardisert flowcytometrieksperiment for å oppnå konsistens og sammenlignbarhet av eksperimentelle resultater i flere sentre, ble det etablert en rask og gjennomførbar standardiseringsmetode for å lette overføringen av protokoller over forskjellige flowcytometre for påvisning av lymfocytter i fullblod hos JE-vaksinerte barn. Seks friske barn (2 år) ble rekruttert fra Beijing Children’s Hospital, Capital Medical University. Etter å ha mottatt en prime og boost-vaksinasjon med en levende-svekket JE SA14-14-2-vaksine mindre enn 6 måneder før, ble perifere blodprøver samlet inn fra frivillige. Svært sammenlignbare data ble innhentet fra forskjellige instrumenter etter standardiserte prosedyrer, noe som er nyttig for multisentervurderinger.
Immunfenotyping av undergrupper av perifere lymfocytter i blodet kan bidra til å forstå endringene i cellemediert adaptiv immunitet etter vaksinasjon hos barn. I kliniske applikasjoner oppstår uventede situasjoner, for eksempel manglende oppdagelse av prøver i tide eller erstatning av et flowcytometer; Derfor er det nødvendig med raske standardiserte metoder som letter overføringer mellom flowcytometre i forskjellige laboratorier 9,10,11.<sup cla…
The authors have nothing to disclose.
RW ble støttet av Beijing Natural Science Foundation, Kina (nr. 7222059), National Natural Science Foundation of China (nr. 82002130), XZ ble støttet av CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (nr. 2019-I2M-5-026).
BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | compensation |
BD FACSCanto | BD | FACSCanto | flow Cytometry A in the transferring lab |
BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD | 655051 | define flow cytometer baseline and track cytometer performance |
BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127 | BD | 562436 | Fluorescent antibody |
BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27 | BD | 562656 | Fluorescent antibody |
BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560777 | Fluorescent antibody |
BD LSRFortessa | BD | LSRFortessa | flow Cytometry B in the test method lab |
BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19 | BD | 745907 | Fluorescent antibody |
BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8 | BD | 751953 | Fluorescent antibody |
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA | BD | 550855 | Fluorescent antibody |
BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3 | BD | 560176 | Fluorescent antibody |
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD | 566320 | Fluorescent antibody |
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25 | BD | 555432 | Fluorescent antibody |
BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD | BD | 561314 | Fluorescent antibody |
Brilliant Staining Buffer Plus | BD | 566385 | Staining Buffer |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 | Cell centrifugation |
Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
CS&T IVD Beads | BD | 662414 | standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer |
Lysing Solution 10x Concentrate | BD | 349202 | lysing red blood cells |
Phosphate-buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | PBS |
Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |