Summary

Standardisering av overføring på tvers av laboratorier mellom flowcytometre for påvisning av lymfocytter hos japanske encefalittvaksinerte barn

Published: February 10, 2023
doi:

Summary

I denne studien ble det utviklet en metode for å lette overføringen av eksperimentelle innstillinger og analysemaler mellom to strømningscytometre i to laboratorier for påvisning av lymfocytter hos japanske encefalittvaksinerte barn. Standardiseringsmetoden for flowcytometereksperimenter vil tillate forskningsprosjekter å bli effektivt utført i flere sentre.

Abstract

Et økende antall laboratorier trenger å samle inn data fra flere strømningscytometre, spesielt for forskningsprosjekter utført på tvers av flere sentre. Utfordringene ved bruk av to flowcytometre i forskjellige laboratorier inkluderer mangel på standardiserte materialer, programvarekompatibilitetsproblemer, inkonsekvenser i instrumentoppsett og bruk av forskjellige konfigurasjoner for forskjellige flowcytometre. For å etablere et standardisert flowcytometrieksperiment for å oppnå konsistens og sammenlignbarhet av eksperimentelle resultater på tvers av flere sentre, ble det etablert en rask og gjennomførbar standardiseringsmetode for å overføre parametere på tvers av forskjellige flowcytometre.

Metodene utviklet i denne studien tillot overføring av eksperimentelle innstillinger og analysemaler mellom to flowcytometre i forskjellige laboratorier for påvisning av lymfocytter hos japanske encefalitt (JE) -vaksinerte barn. En konsistent fluorescensintensitet ble oppnådd mellom de to cytometrene ved bruk av fluorescensstandardperler for å etablere cytometerinnstillingene. Sammenlignbare resultater ble oppnådd i to laboratorier med forskjellige typer instrumenter. Ved hjelp av denne metoden kan vi standardisere analyse for evaluering av immunfunksjonen til JE-vaksinerte barn i forskjellige laboratorier med forskjellige instrumenter, redusere forskjellene i data og resultater mellom flowcytometre i flere sentre, og gi en gjennomførbar tilnærming for gjensidig akkreditering av laboratorieresultater. Standardiseringsmetoden for flowcytometereksperimenter vil sikre effektiv ytelse av forskningsprosjekter på tvers av flere sentre.

Introduction

Standardiseringen av flowcytometri er nyttig for sammenlignbarheten av resultater oppnådd fra forskjellige cytometre på tvers av forskjellige laboratorier og studiesentre, og bidrar til gjensidig anerkjennelse av resultater for å forbedre arbeidseffektiviteten. Stadig flere scenarier krever standardisering. Under legemiddelutviklingsprosessen er standardisering av flowcytometri viktig, da en utviklet og validert analyse vil støtte hele legemiddelutviklingsprosessen fra preklinisk til klinisk analyse. Flowcytometriske metoder overføres ofte mellom farmasøytisk industri og samarbeidende laboratorier1. Videre er det viktig å innhente sammenlignbare data fra multisentriske kliniske studier. For eksempel ble det utviklet en standardiseringsarbeidsflyt i Systemic Autoimmune Diseases Multicenter Clinical Research Project for å oppnå sammenlignbare data fra multisentrisk flowcytometri2.

Standardisering av flowcytometrimetoder er utfordrende. Utfordringene som oppleves på tvers av laboratorier tilskrives mangelen på standardiserte materialer, programvarekompatibilitetsproblemer, inkonsekvenser i instrumentoppsett og bruk av forskjellige konfigurasjoner mellom forskjellige strømningscytometre og divergerende gatingstrategier mellom sentrene 3,4. Derfor er det viktig å gjennomføre en gapanalyse mellom laboratorier. Prøvetilgang, kvalitetssystemer, personellkvalifikasjoner og instrumentkonfigurasjon må gjennomgås for å sikre at kravene oppfylles.

For tiden har barn vaksinert med den japanske encefalittvaksinen (JE) en signifikant redusert forekomst av JE5. Overvåking av perifere blodimmunceller kan bidra til å forstå endringene i cellemediert adaptiv immunitet etter vaksinasjon, og sammenhengen mellom endringene i undergrupper av perifere lymfocytter i blodet og effekten av vaksinasjon. På grunn av den begrensede stabiliteten til fullblodprøver, blir evalueringer av vaksineeffekt ofte utført i flere sentre. For denne analysen definerte vi naive CD8+- eller CD4+ T-celler som CD27+ CD45RA+, sentrale minne-T-celler (TCM) som CD27+ CD45RA-, effektorminne-T-celler (TEM) som CD27-CD45RA-, og terminalt differensierte effektorminne-T-celler (TEMRA) som CD27– CD45RA+. CD19+ B-celler kan deles inn i populasjoner som uttrykker CD27 versus IgD 6,7, naive B-celler uttrykker CD27n-minne B-celler (mBC) kan identifiseres basert på ekspresjonen av IgD6, og regulatoriske T-celler (Tregs) kan identifiseres som CD4+CD25++CD127lav 8. For å etablere et standardisert flowcytometrieksperiment for å oppnå konsistens og sammenlignbarhet av eksperimentelle resultater i flere sentre, ble det etablert en rask og gjennomførbar standardiseringsmetode for å lette overføringen av protokoller over forskjellige flowcytometre for påvisning av lymfocytter i fullblod hos JE-vaksinerte barn. Seks friske barn (2 år) ble rekruttert fra Beijing Children’s Hospital, Capital Medical University. Etter å ha mottatt en prime og boost-vaksinasjon med en levende-svekket JE SA14-14-2-vaksine mindre enn 6 måneder før, ble perifere blodprøver samlet inn fra frivillige. Svært sammenlignbare data ble innhentet fra forskjellige instrumenter etter standardiserte prosedyrer, noe som er nyttig for multisentervurderinger.

Protocol

Studien ble godkjent av etikkomiteen ved Beijing Children’s Hospital, Capital Medical University (godkjenningsnummer: 2020-k-85). Informert samtykke fra forsøkspersoner ble frafalt da kun restprøver etter klinisk testing ble brukt i denne studien. To laboratorier er involvert i denne studien. Overføringslaboratoriet er der den standardiserte metoden ble utviklet ved hjelp av ett flowcytometer. Cytometeret i dette laboratoriet blir heretter referert til som cytometer A. Testmet…

Representative Results

Figur 1 viser et globalt regneark for målverdimalen for CST-lyse perler. Ved hjelp av et FSC/SSC-plott tegnes en polygonport for å velge CSTs lyse perler. Histogramplott av 10 fluorescenskanaler ble oppnådd for CST-lyse perler: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 og BV605. Målverdien for hver parameter vises ved å vise medianen innenfor histogramportene i tabell 2. Skjermbilder av maler og parameterinnstillinger i programvaren til cytometer A og cyto…

Discussion

Immunfenotyping av undergrupper av perifere lymfocytter i blodet kan bidra til å forstå endringene i cellemediert adaptiv immunitet etter vaksinasjon hos barn. I kliniske applikasjoner oppstår uventede situasjoner, for eksempel manglende oppdagelse av prøver i tide eller erstatning av et flowcytometer; Derfor er det nødvendig med raske standardiserte metoder som letter overføringer mellom flowcytometre i forskjellige laboratorier 9,10,11.<sup cla…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

RW ble støttet av Beijing Natural Science Foundation, Kina (nr. 7222059), National Natural Science Foundation of China (nr. 82002130), XZ ble støttet av CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (nr. 2019-I2M-5-026).

Materials

BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set BD 552843 compensation
BD FACSCanto BD FACSCanto flow Cytometry A in the transferring lab
BD FACSDiva CS&T Research Beads BD 655051 define flow cytometer baseline and track cytometer performance
BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127 BD 562436 Fluorescent antibody 
BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27 BD 562656 Fluorescent antibody 
BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45 BD 560777 Fluorescent antibody 
BD LSRFortessa BD LSRFortessa flow Cytometry B in the test method lab
BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19 BD 745907 Fluorescent antibody 
BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8 BD 751953 Fluorescent antibody 
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA BD 550855 Fluorescent antibody 
BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3 BD 560176 Fluorescent antibody 
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4 BD 566320 Fluorescent antibody 
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25 BD 555432 Fluorescent antibody 
BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD BD 561314 Fluorescent antibody 
Brilliant Staining Buffer Plus BD 566385 Staining Buffer
Centrifuge Eppendorf 5810 Cell centrifugation
Centrifuge Tube BD Falcon BD-35209715 15 mL centrifuge tube
CS&T IVD Beads BD 662414 standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer
Lysing Solution 10x Concentrate BD 349202 lysing red blood cells
Phosphate-buffered Saline (PBS) Gibco 10010-023 PBS
Round-bottom test tube BD Falcon 352235 5 mL test tube

References

  1. Cabanski, M., et al. Flow cytometric method transfer: Recommendations for best practice. Cytometry Part B. Clinical Cytometry. 100 (1), 52-62 (2021).
  2. Le Lann, L., et al. Standardization procedure for flow cytometry data harmonization in prospective multicenter studies. Scientific Reports. 10 (1), 11567 (2020).
  3. Linskens, E., et al. Improved standardization of flow cytometry diagnostic screening of primary immunodeficiency by software-based automated gating. Frontiers in Immunology. 11, 584646 (2020).
  4. Glier, H., et al. Standardization of 8-color flow cytometry across different flow cytometer instruments: A feasibility study in clinical laboratories in Switzerland. Journal of Immunological Methods. 475, 112348 (2019).
  5. Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLOS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), e0010562 (2022).
  6. Ding, Y., et al. Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (3), 970-973 (2018).
  7. Zhang, L., et al. Detection of polyfunctional T cells in children vaccinated with Japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique. Journal of Visualized Experiments. (187), e64671 (2022).
  8. Yu, N., et al. CD4(+) CD25 (+) CD127 (low/-) T cells: a more specific Treg population in human peripheral blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1180 (2012).
  9. Kalina, T. Reproducibility of flow cytometry through standardization: opportunities and challenges. Cytometry Part A. 97 (2), 137-147 (2020).
  10. Sommer, U., et al. Implementation of highly sophisticated flow cytometry assays in multicenter clinical studies: considerations and guidance. Bioanalysis. 7 (10), 1299-1311 (2015).
  11. Glier, H., et al. Comments on EuroFlow standard operating procedures for instrument setup and compensation for BD FACS Canto II, Navios and BD FACS Lyric instruments. Journal of Immunological Methods. 475, 112680 (2019).
check_url/kr/64949?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Ge, H., Zhang, L., Liu, M., Yang, X., Wu, X., Wang, R., Xie, Z. Standardization of Transfer across Labs between Flow Cytometers for Detection of Lymphocytes in Japanese Encephalitis Vaccinated Children. J. Vis. Exp. (192), e64949, doi:10.3791/64949 (2023).

View Video