Japon Ensefaliti Aşılı Çocuklarda Lenfositlerin Tespiti için Akış Sitometreleri Arasında Laboratuvarlar Arasında Transferin Standardizasyonu
Summary
Bu çalışmada, Japon ensefalit aşılı çocuklarda lenfositlerin tespiti için iki laboratuvarda iki akış sitometresi arasında deneysel ortamların ve analiz şablonlarının transferini kolaylaştırmak için bir yöntem geliştirilmiştir. Akış sitometresi deneyleri için standardizasyon yöntemi, araştırma projelerinin birden fazla merkezde etkili bir şekilde yürütülmesini sağlayacaktır.
Abstract
Giderek artan sayıda laboratuvarın, özellikle birden fazla merkezde gerçekleştirilen araştırma projeleri için çoklu akış sitometrelerinden veri toplaması gerekmektedir. Farklı laboratuvarlarda iki akış sitometresi kullanmanın zorlukları, standartlaştırılmış malzemelerin eksikliğini, yazılım uyumluluk sorunlarını, cihaz kurulumundaki tutarsızlıkları ve farklı akış sitometreleri için farklı konfigürasyonların kullanılmasını içerir. Birden fazla merkezde deneysel sonuçların tutarlılığını ve karşılaştırılabilirliğini sağlamak için standartlaştırılmış bir akış sitometrisi deneyi oluşturmak için, parametreleri farklı akış sitometreleri arasında aktarmak için hızlı ve uygulanabilir bir standardizasyon yöntemi oluşturulmuştur.
Bu çalışmada geliştirilen yöntemler, Japon ensefaliti (JE) aşılı çocuklarda lenfositlerin tespiti için farklı laboratuvarlardaki iki akış sitometresi arasında deneysel ortamların ve analiz şablonlarının aktarılmasına olanak sağlamıştır. Sitometre ayarlarını oluşturmak için floresan standart boncuklar kullanılarak iki sitometre arasında tutarlı bir floresan yoğunluğu elde edildi. Farklı cihaz tiplerine sahip iki laboratuvarda karşılaştırılabilir sonuçlar elde edilmiştir. Bu yöntemi kullanarak, Je aşılı çocukların bağışıklık fonksiyonlarını farklı laboratuvarlarda farklı aletlerle değerlendirmek için analizleri standartlaştırabilir, birden fazla merkezdeki akış sitometreleri arasındaki veri ve sonuç farklılıklarını azaltabilir ve laboratuvar sonuçlarının karşılıklı akreditasyonu için uygulanabilir bir yaklaşım sağlayabiliriz. Akış sitometresi deneylerinin standardizasyon yöntemi, araştırma projelerinin birden fazla merkezde etkili bir şekilde gerçekleştirilmesini sağlayacaktır.
Introduction
Akış sitometrisinin standardizasyonu, farklı laboratuvarlar ve çalışma merkezleri arasında farklı sitometrelerden elde edilen sonuçların karşılaştırılabilirliği için yararlıdır ve iş verimliliğini artırmak için sonuçların karşılıklı olarak tanınmasına elverişlidir. Giderek artan sayıda senaryo standardizasyon gerektirmektedir. İlaç geliştirme sürecinde, akış sitometrisi standardizasyonu önemlidir, çünkü geliştirilmiş ve doğrulanmış bir tahlil, klinik öncesi analizden klinik analize kadar tüm ilaç geliştirme sürecini destekleyecektir. Akış sitometrik yöntemleri sıklıkla ilaç endüstrisi ile işbirliği yapan laboratuvarlar arasında aktarılır1. Ayrıca, çok merkezli klinik çalışmalardan karşılaştırılabilir veriler elde etmek esastır. Örneğin, çok merkezli akış sitometrisi2’den karşılaştırılabilir veriler elde etmek için Sistemik Otoimmün Hastalıklar Çok Merkezli Klinik Araştırma Projesi’nde bir standardizasyon iş akışı geliştirilmiştir.
Akım sitometri yöntemlerinin standardizasyonu zordur. Laboratuvarlarda yaşanan zorluklar, standartlaştırılmış malzemelerin eksikliğine, yazılım uyumluluğu sorunlarına, cihaz kurulumundaki tutarsızlıklara ve farklı akış sitometreleri arasında farklı konfigürasyonların kullanılmasına ve merkezler arasındaki farklı geçiş stratejilerine bağlanmaktadır 3,4. Bu nedenle, laboratuvarlar arasında bir boşluk analizi yapmak önemlidir. Numune erişimi, kalite sistemleri, personel nitelikleri ve cihaz konfigürasyonu, gereksinimlerin karşılandığından emin olmak için gözden geçirilmelidir.
Şu anda, Japon ensefaliti (JE) aşısı ile aşılanan çocuklar, JE5 insidansında önemli ölçüde azalmaya sahiptir. Periferik kan immün hücrelerinin izlenmesi, aşılama sonrası hücre aracılı adaptif bağışıklıktaki değişiklikleri ve periferik kan lenfosit alt kümelerindeki değişiklikler ile aşılamanın etkileri arasındaki korelasyonu anlamaya yardımcı olabilir. Tam kan örneklerinin sınırlı stabilitesi nedeniyle, aşı etkinliğinin değerlendirilmesi genellikle birden fazla merkezde yapılmaktadır. Bu analiz için naif CD8+ veya CD4+ T hücrelerini CD27+ CD45RA+, merkezi bellek T hücrelerini (T CM) CD27+ CD45RA-, efektör bellek T hücrelerini (TEM) CD27- CD45RA-, terminal olarak farklılaşmış efektör bellek T hücrelerini (T EMRA) CD27– CD45RA+ olarak tanımladık. CD19+ B hücreleri, CD27’yi IgD 6,7’ye karşı eksprese eden popülasyonlara ayrılabilir, naif B hücreleri CD27n bellek B hücrelerini (mBC’ler) eksprese eder, IgD6’nın ekspresyonuna dayanarak tanımlanabilir ve düzenleyici T hücreleri (Tregs) CD4 + CD25 + + CD127düşük 8 olarak tanımlanabilir. Birden fazla merkezde deneysel sonuçların tutarlılığını ve karşılaştırılabilirliğini sağlamak için standartlaştırılmış bir akış sitometrisi deneyi oluşturmak için, Je aşılı çocukların tam kanındaki lenfositlerin tespiti için protokollerin farklı akış sitometreleri arasında transferini kolaylaştırmak için hızlı ve uygulanabilir bir standardizasyon yöntemi oluşturulmuştur. Altı sağlıklı çocuk (2 yaşında) Başkent Tıp Üniversitesi Pekin Çocuk Hastanesi’nden işe alındı. 6 aydan daha kısa bir süre önce canlı zayıflatılmış bir JE SA14-14-2 aşısı ile bir prime ve boost aşılaması aldıktan sonra, gönüllülerden periferik kan örnekleri toplandı. Çok merkezli değerlendirmeler için yararlı olan standartlaştırılmış prosedürleri takip eden farklı araçlardan son derece karşılaştırılabilir veriler elde edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Periferik kan lenfosit alt gruplarının immünofenotiplenmesi, çocuklarda aşılama sonrası hücre aracılı adaptif bağışıklıktaki değişikliklerin anlaşılmasına yardımcı olabilir. Klinik uygulamalarda, numunelerin zamanında tespit edilememesi veya bir akış sitometresinin değiştirilmesi gibi beklenmeyen durumlar ortaya çıkar; bu nedenle, farklı laboratuvarlardaki akış sitometreleri arasında transferleri kolaylaştıran hızlı standartlaştırılmış yöntemlere ihtiyaç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RW, Pekin Doğa Bilimleri Vakfı, Çin (No. 7222059), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82002130), XZ, Tıp Bilimleri için CAMS İnovasyon Fonu (No. 2019-I2M-5-026) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | compensation |
| BD FACSCanto | BD | FACSCanto | flow Cytometry A in the transferring lab |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD | 655051 | define flow cytometer baseline and track cytometer performance |
| BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127 | BD | 562436 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27 | BD | 562656 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560777 | Fluorescent antibody |
| BD LSRFortessa | BD | LSRFortessa | flow Cytometry B in the test method lab |
| BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19 | BD | 745907 | Fluorescent antibody |
| BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8 | BD | 751953 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA | BD | 550855 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3 | BD | 560176 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD | 566320 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25 | BD | 555432 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD | BD | 561314 | Fluorescent antibody |
| Brilliant Staining Buffer Plus | BD | 566385 | Staining Buffer |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 | Cell centrifugation |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| CS&T IVD Beads | BD | 662414 | standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer |
| Lysing Solution 10x Concentrate | BD | 349202 | lysing red blood cells |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | PBS |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
References
- Cabanski, M., et al. Flow cytometric method transfer: Recommendations for best practice. Cytometry Part B. Clinical Cytometry. 100 (1), 52-62 (2021).
- Le Lann, L., et al. Standardization procedure for flow cytometry data harmonization in prospective multicenter studies. Scientific Reports. 10 (1), 11567 (2020).
- Linskens, E., et al. Improved standardization of flow cytometry diagnostic screening of primary immunodeficiency by software-based automated gating. Frontiers in Immunology. 11, 584646 (2020).
- Glier, H., et al. Standardization of 8-color flow cytometry across different flow cytometer instruments: A feasibility study in clinical laboratories in Switzerland. Journal of Immunological Methods. 475, 112348 (2019).
- Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLOS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), e0010562 (2022).
- Ding, Y., et al. Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (3), 970-973 (2018).
- Zhang, L., et al. Detection of polyfunctional T cells in children vaccinated with Japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique. Journal of Visualized Experiments. (187), e64671 (2022).
- Yu, N., et al. CD4(+) CD25 (+) CD127 (low/-) T cells: a more specific Treg population in human peripheral blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1180 (2012).
- Kalina, T. Reproducibility of flow cytometry through standardization: opportunities and challenges. Cytometry Part A. 97 (2), 137-147 (2020).
- Sommer, U., et al. Implementation of highly sophisticated flow cytometry assays in multicenter clinical studies: considerations and guidance. Bioanalysis. 7 (10), 1299-1311 (2015).
- Glier, H., et al. Comments on EuroFlow standard operating procedures for instrument setup and compensation for BD FACS Canto II, Navios and BD FACS Lyric instruments. Journal of Immunological Methods. 475, 112680 (2019).
